OGP對(duì)奶牛成骨細(xì)胞、骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的作用及其微囊化研究.pdf

1、成骨生長(zhǎng)肽（Osteogenic growth peptide，OGP）是一種高效促成骨及造血刺激因子。普遍存在于哺乳動(dòng)物的血液中，對(duì)促進(jìn)骨形成、松質(zhì)骨密度及骨折的愈合具有重要的意義。有研究發(fā)現(xiàn)，OGP通過(guò)自分泌及旁分泌途徑，促進(jìn)人及嚙齒目動(dòng)物的成骨細(xì)胞及骨髓基質(zhì)干細(xì)胞分化、堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase，ALP）活性及基質(zhì)礦化。本試驗(yàn)從以下五個(gè)方面探討了OGP對(duì)奶牛骨髓基質(zhì)干細(xì)胞及成骨細(xì)胞作用及調(diào)控機(jī)制，并對(duì)OG

2、P轉(zhuǎn)基因細(xì)胞微囊生物學(xué)特性進(jìn)行研究。
　　 1.奶牛骨鈣素抗體制備
　　 以奶牛骨組織提取的RNA為模板，利用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增出奶牛骨鈣素（Bone calcium protein，BGP）全長(zhǎng)cDNA，然后將擴(kuò)增產(chǎn)物重組到PMD-18T載體中，測(cè)定了全基因的核苷酸序列。序列分析表明，奶牛骨鈣素全長(zhǎng)cDNA為303bp，編碼100個(gè)氨基酸，與GenBank中的X53699的序列完全相同。通過(guò)重疊延伸PCR技術(shù)連接單鏈

3、DNA片段人工定點(diǎn)同義突變，將奶牛骨鈣素成熟蛋白基因中的大腸桿菌稀有密碼子同義突變成大腸桿菌常用密碼子并亞克隆到PET-32a表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化到宿主菌BL21（DE3），經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，成功表達(dá)出奶牛骨鈣素融合蛋白，并成功制備奶牛骨鈣素多抗血清，為后續(xù)試驗(yàn)提供了抗體。
　　 2.OGP對(duì)奶牛骨髓基質(zhì)干細(xì)胞增殖、分化及礦化的影響及其調(diào)控機(jī)制研究
　　 本試驗(yàn)研究了OGP對(duì)奶牛體外培養(yǎng)的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞增殖及分化特性的作用。結(jié)

4、果發(fā)現(xiàn)，成骨生長(zhǎng)肽能促進(jìn)奶牛骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的增殖，并能促進(jìn)奶牛骨髓基質(zhì)干細(xì)胞ALP活性及礦化的形成，另外能刺激BGP mRNA的表達(dá)。OGP能刺激奶牛骨髓基質(zhì)干細(xì)胞內(nèi)皮一氧化氮合成酶（Endothelial nitric oxide synthases，eNOS）的表達(dá)，當(dāng)eNOS表達(dá)受到抑制時(shí)，OGP對(duì)奶牛骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的促分化活性受到抑制。由此認(rèn)為，OGP能刺激奶牛骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的增殖及向成骨細(xì)胞分化，并且是通過(guò)eNOS介導(dǎo)。

5、>　　 3.OGP對(duì)奶牛成骨細(xì)胞增殖、分化及礦化的影響及其調(diào)控機(jī)制研究
　　 本試驗(yàn)研究了外源性O(shè)GP對(duì)體外培養(yǎng)的奶牛成骨細(xì)胞增殖、分化及礦化的影響。組織塊移行法分離奶牛成骨細(xì)胞，通過(guò)形態(tài)觀察及堿性磷酸酶活性鑒定。MTT法檢測(cè)不同濃度OGP對(duì)成骨細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。細(xì)胞質(zhì)堿性磷酸酶活性及骨鈣素水平分別通過(guò)比色法檢測(cè)及放射免疫法測(cè)定。硒素紅染色觀察礦化結(jié)節(jié)。結(jié)果顯示，成骨生長(zhǎng)肽能明顯促進(jìn)奶牛成骨細(xì)胞的增殖，最大效應(yīng)濃度為10-9M；

6、并且能促進(jìn)成骨細(xì)胞ALP活性、骨鈣素及礦化結(jié)節(jié)的形成；當(dāng)抑制osterix基因表達(dá)，成骨生長(zhǎng)肽促進(jìn)奶牛成骨細(xì)胞ALP活性及骨鈣素分泌相應(yīng)受到抑制。由此揭示，OGP對(duì)奶牛成骨細(xì)胞增殖及分化具有促進(jìn)，并且是通過(guò)上調(diào)osterix介導(dǎo)。
　　 4.體內(nèi)氧自由基對(duì)移植細(xì)胞微囊活性的影響
　　 為了揭示細(xì)胞微囊移植過(guò)程中宿主體內(nèi)氧自由基的動(dòng)態(tài)變化特征。將細(xì)胞微囊、空微囊以及生理鹽水在移植小鼠體內(nèi)后1、4、7天，檢測(cè)血清自由基，MD

7、A及SOD水平。過(guò)氧化氫及MDA水平在空微囊移植后瞬時(shí)升高，后又降低到正常水平，但是細(xì)胞微囊移植組，移植后持續(xù)升高。NO及SOD水平在空微囊及細(xì)胞微囊移植組均升高，但是生理鹽水注射組無(wú)明顯變化。細(xì)胞微囊在移植7天后回收，通過(guò)AO/EB染色發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞具有良好的活性。由此認(rèn)為，NO是微囊特異性的刺激形成因子，氧自由基在微囊移植早期迅速升高，但是由于體內(nèi)抗氧化物酶升高從而能有效清除。
　　 5.OGP轉(zhuǎn)基因細(xì)胞微囊體內(nèi)及體外增殖及分泌

8、特性
　　 研究為OGP轉(zhuǎn)基因細(xì)胞微囊在體內(nèi)及體外的增殖及分泌特征。本試驗(yàn)檢測(cè)了OGP轉(zhuǎn)基因細(xì)胞微囊在體外培養(yǎng)條件下的增殖及OGP分泌活性，并將微囊細(xì)胞移植入骨質(zhì)疏松疾病模型體內(nèi)，檢測(cè)微囊內(nèi)細(xì)胞增殖及OGP分泌活性，并對(duì)骨質(zhì)疏松疾病模型體內(nèi)氧自由基及抗氧化物酶的活性進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果顯示，OGP轉(zhuǎn)基因細(xì)胞微囊在體外培養(yǎng)條件下具有良好的增殖及分泌活性，而在骨質(zhì)疏松疾病模型體內(nèi)細(xì)胞大量死亡，宿主動(dòng)物血清OGP含量無(wú)明顯變化。骨質(zhì)疏松模