一株B亞型ALV的分離、前病毒全基因組序列分析和感染性克隆的構(gòu)建.pdf

1、本文通過將孵化9-11d的種蛋制備雞胚成纖維細胞培養(yǎng)，盲傳3代(共9d)后，取ALV-p27抗原檢測陽性的細胞上清液接種DF-1細胞系以排除內(nèi)源性ALV干擾的方法，從山東某地方培育品系的雞群中分離到一種外源性禽白血病病毒SDAU09E3。PCR擴增其env基因進行克隆測序，并與A、B、C、D、E、J亞群參考毒株進行了同源性分析，表明該分離株gp85的氨基酸序列與4株ALV-B參考株的同源性最高，均大于91％，而與其他亞型ALV參考株的同

2、源性均低于87.9％，因此將此分離株劃歸為B亞群。根據(jù)GenBank中已發(fā)表不同亞群全基因組序列設(shè)計合成8對連續(xù)、相互部分重疊的引物，利用這些引物和分段克隆測序的方法，完成了該外源性禽白血病病毒分離株SDAU09E3的前病毒全基因組核苷酸序列測定(登錄號為JF826241)，并分析了其結(jié)構(gòu)基因和LTR與其他參考毒株的序列同源性和差異。同時還比較了從山東地方品系雞群分離到的二株B亞型禽白血病病毒(ALV)SDAU09E3和SDAU09C2

3、的全基因組序列及它們在細胞培養(yǎng)上的復制動態(tài)。這二株ALV-B的同源性為95.4％，與Genbank中3株B亞群參考株之間的同源性也均在91.0％～94.9％1間，而與其它亞群參考株的同源性均低于87.9％。與亞群無關(guān)的gag、pol基因和LTR的核苷酸序列比較表明，這二株ALV-B的gag和pol基因與所有比較的參考株的同源性均在93％以上。LTR與其他外源性ALV參考株的LTR間的同源性在72.6％～88.3％范圍內(nèi)，但與E亞群內(nèi)源性

4、ALV的LTR的同源性只有51.5％。然而，這二個ALV-B的LTR的同源性也只有74.8％，遠低于其他基因組部分的同源性，特別是它們的LTR的U3區(qū)同源性只有68.8％，二者在二個CAAT分布上也顯著不同。對這二株ALV-B在DF-1細胞上的復制動態(tài)比較表明，它們在細胞培養(yǎng)上清液中的TCID50值非常類似，但SDAU09E3株核衣殼蛋白p27抗原的含量顯著高于SDAU09C2株。這表明，同一亞群的不同毒株在復制過程中，所表達的p27抗

5、原量與所形成的具有傳染性的病毒量間沒有平行關(guān)系。這一差異與LTR-U3區(qū)的相關(guān)性則有待應(yīng)用感染性克隆技術(shù)來做進一步深入研究。
　　 根據(jù)B亞型白血病病毒SDAU09E3前病毒基因組序列，設(shè)計覆蓋全長的三對重疊引物，以提取感染SDAU09E3病毒的DF-1細胞DNA為模板，采用PCR方法分3段擴增出B亞型白血病病毒SDAU09E3株的前病毒cDNA，PCR產(chǎn)物經(jīng)克隆后順次連接入pUC19，獲得一個含有完整ALV-B前病毒cDNA的

6、重組質(zhì)粒，命名為pUC19-SDAU09E3。重組質(zhì)粒純化后轉(zhuǎn)染DF-1細胞，經(jīng)抗ALV-A和ALV-B的小鼠血清對轉(zhuǎn)染后的細胞作間接免疫熒光試驗，收集轉(zhuǎn)染后的p27檢測陽性的細胞上清再感染DF-1細胞并傳代檢測細胞上清p27仍為陽性，證明獲得了具有感染性的克隆化病毒rSDAU09E3，為進一步的研究奠定了基礎(chǔ)。在構(gòu)建的B亞型ALV感染性克隆的基礎(chǔ)上，將病毒腫瘤基因-fps基因經(jīng)適當修飾后插入SDAU09E3的前病毒基因組中的env和3