紫花苜蓿幾丁質(zhì)酶Class I基因的克隆、序列分析及其表達.pdf

1、幾丁質(zhì)酶(EC3.2.2.14,Chitinase)簡稱Chi,分布廣泛,以幾丁質(zhì)作為它的天然底物。病原真菌細胞壁的主要成分之一也是幾丁質(zhì),幾丁質(zhì)酶可以通過降解病原真菌細胞壁中的幾丁質(zhì),以達到抑制真菌生長的目的,且被分解后的細胞壁碎片還可以誘發(fā)寄主植物自身的抗病性增強。此外,有些幾丁質(zhì)酶兼有溶菌酶活性,可以通過破壞病原菌的內(nèi)部結(jié)構(gòu)使病原菌致死。幾丁質(zhì)酶的這些特性使它成為當前抗病基因工程育種的研究焦點之一。
　　 紫花苜蓿(Med

2、icago sattiva L.)為多年生豆科牧草,以產(chǎn)量高、適口性好而聞名。然而,近年來,苜蓿根腐病病害成為制約它發(fā)展的一大重要因素。本研究基于這一點考慮,通過向植物中導(dǎo)入外源幾丁質(zhì)酶基因,使其在植物體內(nèi)表達,從而提高植物體對植物病害的抗性,已達到防治植物病害的目的,為進一步研究將幾丁質(zhì)酶基因?qū)胱匣ㄜ俎４蛳吕碚摶A(chǔ)。
　　 主要研究成果如下:
　　 1.本研究依據(jù)NCBI中已登錄的截形苜蓿(Medicago trun

3、catula)幾丁質(zhì)酶基因的一段EST序列(GenBank登錄號:AF167323)設(shè)計引物,以“中苜6號”的RNA為模板,利用RACE技術(shù)進行cDNA全長克隆,分別擴增出400bp(3’-RACE)和800bp(5’-RACE)的片段；
　　 2.利用生物信息學(xué)軟件對該序列進行分析得知:該基因全長1132bp,其中含有一個930bp的開放閱讀框,編碼309個氨基酸。將該基因命名為MsChiⅠ(GenBank登錄號:HM2244

4、49)。聚類分析顯示:它與其他已知植物ClassⅠ類幾丁質(zhì)酶基因具有高度的同源性；功能分析可知:該蛋白為親水性非跨膜蛋白,屬于幾丁質(zhì)酶第19家族；
　　 3.采用限制性內(nèi)切酶(NcoⅠ和SpeⅠ)雙酶切法,構(gòu)建了植物表達載體MsChi-pCAMBIA1302,并采用凍融法導(dǎo)入農(nóng)桿菌LBA4404中,用干煙草的轉(zhuǎn)化；
　　 4.通過共培養(yǎng)、篩選、再生得到轉(zhuǎn)基因煙草植株,并進行PCR、RT-PCR的分子檢測,說明目的基因已經(jīng)