天然色素發(fā)酵工藝優(yōu)化[畢業(yè)設計]

1、<p>　　本科畢業(yè)設計(論文)</p><p><b>　　（二零 屆）</b></p><p>　　天然色素發(fā)酵工藝優(yōu)化 </p><p>　　所在學院 </p><p>　　專業(yè)班級 生物工程 &l

2、t;/p><p>　　學生姓名 學號 </p><p>　　指導教師 職稱 </p><p>　　完成日期 年 月 </p><p>　　天然色素發(fā)酵工藝優(yōu)化</p><p>　　摘要: 靈

3、菌紅素(prodigiosins，PG)是一些放線菌、沙雷氏菌及其它細菌產生的具有重要生物活性的次級代謝產物。本實驗通過單因子和PLACKETT-BURMAN，爬坡響應面實驗設計，對沙雷氏菌發(fā)酵工藝進行研究，發(fā)現通過提高蛋白胨濃度并降低氯化鈉的含量可以大幅提高靈菌紅素產量,并找到了一個優(yōu)于現有配方的培養(yǎng)基配比，使靈菌紅素產量提高了42.85%。</p><p>　　關鍵詞: 靈菌紅素；沙雷氏菌；培養(yǎng)基優(yōu)化；<

4、;/p><p>　　Natural pigment fermentation process optimization</p><p>　　Abstract: Prodigiosins with important biological activity secondary metabolites are produced by a number of Actinomycetes, Serr

5、atia and other bacteria. Through the investigation of single-factor experiment and PLACKETT-BURMAN design, Conditions of fermentation of Prodigiosins were investigated. It was found that by increasing the concentration

6、 of peptone and decreasing the concentration of sodium chloride can heavily increase the production of Prodigiodins. And under the new formula, the yiel</p><p>　　Keywords: prodigiosins; Serratia; medium opti

7、mization; </p><p><b>　　目 錄</b></p><p><b>　　摘要: I</b></p><p>　　Abstract: .II</p><p><b>　　1 緒論1</b></p><p>　　1.1

8、靈菌紅素的基本性質1</p><p>　　1.2 背景及意義1</p><p>　　2 方法與材料3</p><p>　　2.1 實驗材料3</p><p>　　2.1.1 菌種3</p><p>　　2.1.2 主要儀器與試劑3</p><p>　　2.1.3 培養(yǎng)基

9、3</p><p>　　2.2 實驗方法3</p><p>　　2.2.1 種子的培養(yǎng)和優(yōu)化3</p><p>　　2.2.2 種子的擴大培養(yǎng)4</p><p>　　2.2.3 紅色素與菌體的提取4</p><p>　　2.2.4 靈菌紅素含量測定4</p><p>　　2.

10、2.5 靈菌紅素吸光度標準曲線測定4</p><p>　　2.2.7 PLACKETT-BURMAN實驗5</p><p>　　3 結果與分析7</p><p>　　3.1 標準曲線的測定7</p><p>　　3.2 單因素實驗7</p><p>　　3.3 PLACKETT-BURMAN實驗1

11、1</p><p>　　3.4 爬坡實驗12</p><p>　　3.6 驗證實驗14</p><p>　　4 結論...........................................................................................................................

12、...........................15</p><p><b>　　參考文獻16</b></p><p>　　致 謝錯誤!未定義書簽。</p><p><b>　　1 緒論</b></p><p>　　1.1 靈菌紅素的基本性質</p><p>　

13、　靈菌紅素(prodigiosins,PG)是一類天然紅色素的總稱，通常都有3個吡咯環(huán)組成的甲氧基吡咯骨架結構，1929年由Amak等研究Serratia生長時發(fā)現，包括prodigioSin，prodigio Sin 25-C，metacyc1oprodigiosin (MP)desmethoxyprodigiosi和uncedy1prodigiosin(UP)等。PG屬于脂溶性色素，易溶于甲醇和丙酮，不溶于水，在極性較強的酸性和堿性

14、水溶液中微溶，在極性較弱的有機溶劑如乙醚或石油醚中微溶或不溶；PG對溫度穩(wěn)定，但受pH的影響較大，酸性環(huán)境中能保持較長的時間，堿性條件下則損失較大[1]；A13+，Ca2+，K+，Ba2+等金屬離子對PG的穩(wěn)定性影響不大，Zn2+有使PG增色的作用，Mg2+和Mn2+對PG有一定的破壞作用，Plackett-Burman2+可以絡PG，使之成為沉淀[2]；白光和藍光使PG發(fā)生光解，在紅光和遠紅光下PG則不會降解[3]。</p>

15、;<p>　　1.2 背景及意義</p><p>　　PG是由一些放線菌、沙雷氏菌及其它細菌產生的次級代謝產物[4，5]，具有抗細菌、抗真菌、抗瘧疾、等活性[6]。PG的產生在菌體生長代謝過程中的作用目前尚有爭議，有學者認為PG的產生有利于菌體的生存競爭，但也有學者認為，PG在菌體生長代謝過程中不起作用，僅為大量初級代謝產物的溢流作用。</p><p>　　近年來靈菌紅素在

16、醫(yī)學上、環(huán)境治理、食品色素以及紡織業(yè)上的應用越來越廣泛。</p><p>　　首先，醫(yī)學上抗腫瘤作用。PG對比起另外一些化學療法藥劑，如環(huán)磷琉胺（cyclophosphamide）具有低細胞毒作用，只有當濃度大于300nM時才具有明顯的淋巴細胞抑制作用。而后者在其有效濃度時毒性已非常高[7]。</p><p>　?、?它能在銅離子配合下破壞癌細胞的雙鏈DNA。而癌細胞相比非癌組織具有較高的

17、銅離子濃度（3.5倍），這也成為PG對癌組織高針對性的基礎。PG還可以通過抑制細胞中型拓撲異構酶I和Ⅱ的活性而進一步達到破化DNA復制的目的。</p><p>　?、?PG可破化細胞內的線粒體，高爾基體和溶酶體對細胞質的pH梯度，降低細胞內ATP水平。這是由于其可以在這些細胞器的膜上起到離子孔的作用，而抵消氫氯離子的同向轉運[8]。</p><p>　?、?靈菌紅素可以激活細胞內細胞凋亡

18、途徑[9]。一方面，靈菌紅素激活前半胱天冬酶8，繼而啟動了細胞內半胱天冬酶依賴的細胞凋亡。另一方面，它也可以使線粒體釋放其細胞凋亡誘導因子（AIF）而觸發(fā)非半胱天冬酶依賴的細胞凋亡[10]。</p><p>　　其次，在環(huán)境治理上[11]，韓國科學家于1996年首次在海洋中發(fā)現一種微生物“哈赫拉”（Hahella）?；蚪M測序分析后發(fā)現其能產生可以清除赤潮的靈菌紅素。將靈菌紅素撒在赤潮中，只需十億分之一的濃度，1

19、h后就能將導致赤潮的浮游生物大部分殺死。這對治理河湖的富營養(yǎng)化及海里的赤潮，維護地球環(huán)境具有重大意義。韓國科學家已為其申請了韓國和國際專利。</p><p>　　再次，作為食品添加劑[12]，合成色素發(fā)明之后，天然色素逐漸被取代。隨著毒理學和分析技術的不斷發(fā)展和人們生活水平的提高，發(fā)現某些合成色素食用過量有致癌危險，而天然色素具有較高的安全性 ?？墒牵烊簧夭荒軡M足現代食品工業(yè)發(fā)展的需要，開發(fā)新品種以及改進原有

20、的天然色素（如靈菌紅素）迫在眉睫。</p><p>　　最后，在紡織業(yè)方面[13]，現如今，隨著人們生活水平的提高，人們對安全，健康，綠色的產品需求日益擴大，為了滿足社會需求，特別是內衣，汗衫，襪子等生產能夠抗菌的紡織物是將來發(fā)展的一大趨勢。</p><p><b>　　2 方法與材料</b></p><p><b>　　2.1

21、實驗材料</b></p><p><b>　　2.1.1 菌種</b></p><p>　　黏質沙雷氏菌( Serratia jx.1)</p><p>　　2.1.2 主要儀器與試劑</p><p>　　HD-930組合式全溫度震蕩培養(yǎng)箱 （大倉市博萊特實驗儀器廠）；</p><p&

22、gt;　　VS-15000CFN II 型小型高速離心機（上海民儀電子有限公司）；</p><p>　　VS-1300型潔凈工作臺（蘇州時速為凈化設備有限公司）；</p><p>　　PHS-3C型精密pH計（上海安亨昌吉149號雷磁儀器廠）；</p><p>　　AL-204型電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；</p><p>　

23、　752s 紫外可見分光光度計 (上海棱光技術有限公司)；</p><p>　　DSX-280A型不銹鋼手提式滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）；</p><p>　　LRH-250A型生化培養(yǎng)箱(廣東省醫(yī)療器械廠）。</p><p>　　本實驗所用丙酮、氯化鈉、硫酸鎂、甘油等均為分析純；PN5247蛋白胨、牛肉浸膏、酵母粉等均為生化試劑。</p><

24、p>　　2.1.3 培養(yǎng)基</p><p>　　種子培養(yǎng)基 (g/L)：牛肉膏3.0，蛋白胨10.0，NaCl 2.0，瓊脂15，pH 7.4-7.6。</p><p>　　擴大培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨 13.0，甘油20.0 .。Nacl 2.0 搖瓶裝液量 20mL/250mL（V/V）pH自然。</p><p>　　發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨13.0

25、, 甘油20.0, MgSO4 1.2, NaCl 2.0, Gly 2.0，搖瓶裝液量50 mL/250mL(V/V)，接種量5％(V/V)，pH 5.7。</p><p><b>　　2.2 實驗方法</b></p><p>　　2.2.1 種子的培養(yǎng)和優(yōu)化</p><p>　　種子培養(yǎng)基的配制：按照種子培養(yǎng)基的組成稱取牛肉膏3.0g，

26、蛋白胨10.0g，NaCl 2.0g，瓊脂15g，放到1000mL的燒杯中加水至1000mL，加熱攪拌溶解，用1mol/L的HCl和1mol/L的NaOH調節(jié)培養(yǎng)基的pH，使其在7.4-7.6[14]。然后分裝在250mL的搖瓶中，用滅菌鍋在121℃下滅菌20min，最后再倒平板。待平板冷卻后在無菌條件下，用接種針挑取甘油管中的菌種劃平板，放在生化培養(yǎng)箱中，37℃培養(yǎng)12h，即得到活化的沙雷氏菌，將其放于冰箱內保存?zhèn)溆谩?lt;/p&g

27、t;<p>　　2.2.2 種子的擴大培養(yǎng)</p><p>　　分別稱?。╣/L）蛋白胨13.0、甘油20.0、NaCl 2.0加入燒杯中加水，攪拌，使燒杯中的物料都溶解并分裝于250mL的搖瓶中，每個搖瓶裝50mL的培養(yǎng)基，并用滅菌鍋在121℃下高溫蒸汽滅菌20min，待搖瓶內的培養(yǎng)基冷卻后在無菌條件下接種，用接種針挑取平板上的單菌落于搖瓶中。接種完后，液體培養(yǎng)12h，培養(yǎng)溫度為27℃，轉速為1

28、70r/min。</p><p>　　2.2.3 紅色素與菌體的提取</p><p>　　轉接后放在搖床里培養(yǎng)48h后取出，搖勻，分別用移液槍移取2.00mL發(fā)酵液于2mL離心管中，4℃，12000r/min，離心6min，棄上清液，然后用移液槍移取1mL的丙酮于各個離心管中，用100μL槍頭攪拌使色素完全溶于丙酮中，再離心，溫度為4℃，12000r/min，離心6min。得到靈菌紅素丙

29、酮溶液。</p><p>　　2.2.4 靈菌紅素含量測定</p><p>　　本實驗利用靈菌紅素在535nm波長下具有最大吸收峰的特性，將提取的靈菌紅素丙酮溶液稀釋250倍后于535nm波長下測量吸光度并利用標準曲線方程計算出發(fā)酵液中靈菌紅素含量。</p><p>　　2.2.5 靈菌紅素吸光度標準曲線測定</p><p>　　稱取少量

30、靈菌紅素固體，用丙酮溶解后抽濾，去除不溶物后自然干燥至質量不變，制得靈菌紅素粗品（下稱粗品）。用分析天平準確稱量0.0200g粗品，定容至25ml制成0.8g/L母液，分別用移液槍吸取150ul，200ul，250ul，300ul，350ul母液于比色管中并用丙酮定容至10ml制成0.012g/L，0.016 g/L，0.020 g/L，0.024 g/L，0.028 g/L溶液，分別測量其吸光度值，計算標準曲線，實驗平行五次。<

31、/p><p>　　2.2.6 單因子實驗</p><p>　　實驗選取Pro，Gly，Asp，His，Nacl，MgSO4，MnSO4,蛋白胨，甘油，甘露醇10個變量，分別進行單因子實驗。實驗以擴大培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基，分別添加上述物質，各制成不同濃度梯度的實驗用培養(yǎng)基，濃度如表1所示。接種后置于28℃，170rpm搖床中培養(yǎng)48h，提取后測量吸光度并換算成濃度，比較各因子的顯著性，實驗平行三次

32、。</p><p>　　表2-1 各單因素的濃度梯度</p><p>　　2.2.7 PLACKETT-BURMAN實驗[15-18]</p><p>　　通過單因素實驗后可以了解各個因素對靈菌紅素產量的影響，選取其中較重要的9個因素進一步進行PLACKETT-BURMAN實驗，觀察各因素對發(fā)酵的綜合影響并選取最顯著的因素進一步進行實驗。PLACKETT-BURMA

33、N實驗中各因素及水平見表2，PLACKETT-BURMAN實驗具體實驗設計見表2-2 PLACKETT-BURMAN實驗涉及的因素和水平</p><p>　　表2-3 PLACKETT-BURMAN實驗的設計</p><p><b>　　3 結果與分析</b></p><p>　　紅色素作為一類具有重要生物活性的微生物次級代謝產物，在醫(yī)藥、紡

34、織、食品等領域均具有巨大的應用潛力，但現報道的紅色素的產量很低，影響了它進一步的研究開發(fā)，本實驗分別考察了不同的培養(yǎng)條件對紅色素的胞外積累量和對菌株生長的影響，以便確定最優(yōu)的發(fā)酵培養(yǎng)條件，獲得最高的紅色素的積累量，加快紅色素的工業(yè)化進程。</p><p>　　3.1 標準曲線的測定</p><p>　　標準曲線如下圖1所示：</p><p>　　圖3-1 靈菌紅素

35、（丙酮）吸光度標準曲線</p><p>　　3.2 單因素實驗</p><p>　　本實驗選擇了共計11個因子，研究各個因子對靈菌紅素產量的影響。各單因子數據如圖3-1～圖3-11所示。</p><p>　　圖3-2 蛋白胨對靈菌紅素產量影響</p><p>　　圖3-3 甘油對靈菌紅素產量影響</p><p>　　

36、圖3-4 天冬氨酸對靈菌紅素產量影響</p><p>　　圖3-5硫酸錳對靈菌紅素產量影響</p><p>　　圖3-6 硫酸鎂對靈菌紅素產量影響</p><p>　　圖3-7 氯化鈉對靈菌紅素產量影響</p><p>　　圖3-8 脯氨酸對靈菌紅素產量影響</p><p>　　圖3-9 甘露醇對靈菌紅素產量影響<

37、;/p><p>　　圖3-10 甘氨酸對靈菌紅素產量影響</p><p>　　圖3-11 組氨酸對靈菌紅素產量影響</p><p>　　從實驗結果可知，天冬氨酸和MnSO4相較于其他因子對靈菌紅素的合成影響較小，應此選取 Pro，Gly，His，Nacl，MgSO4,蛋白胨，甘露醇，甘油，這八個因子進行PLACKETT-BURMAN實驗。

38、 </p><p>　　3.3 PLACKETT-BURMAN實驗</p><p>　　實驗數據通過Design-Expert 7.0 計算得出，實驗結果如表3-1所示，處理結果如表3-2所示。模型顯著（p=0.038）具有統計學意義。</p><p&g

39、t;　　表3-1 PLACKETT-BURMAN實驗結果</p><p>　　表3-2 PLACKETT-BURMAN實驗處理</p><p>　　由分析結果可知影響靈菌紅素產量主要因素為蛋白胨，甘露醇甘氨酸及NaCl的含量，因此進行爬坡實驗。</p><p><b>　　3.4 爬坡實驗</b></p><p>　　表

40、3-3 爬坡實驗的設計及結果</p><p>　　由爬坡結果可知影響靈菌紅素產量蛋白胨，甘露醇，甘氨酸及NaCl的濃度梯度及最適濃度。</p><p>　　表3-4 響應面濃度水平</p><p>　　3.5 Response Surface實驗</p><p>　　表3-5 Response Surfac實驗的設計（g/L）</

41、p><p>　　圖3-12 響應面3D圖分析1</p><p>　　圖3-13 響應面3D圖分析2</p><p>　　Final Equation in Terms of Actual Factors:</p><p>　　吸光度 = - 0.72675 - 0.019750*甘氨酸 + 0.03467*甘露醇 + 0.11088*蛋白胨

42、</p><p>　　+ 4.50000E-003*甘氨酸*甘露醇 - 3.25000E-003*甘氨酸 * 蛋白胨</p><p>　　- 1.00000E-003*甘露醇*蛋白胨 + 0.012500*甘氨酸2 </p><p>　　- 8.75000E-004*甘露醇2 - 2.32031E-003*蛋白胨2</p><p>　　利

43、用偏方求導計算得到（理論產量max：5g/L）的最優(yōu)組合為：</p><p>　　甘氨酸1.5g/L,甘露醇12g/L，蛋白胨20g/L，NaCl 2g/L，MgSO4 1.2g/L，脯氨酸10g/L</p><p><b>　　3.6 驗證實驗</b></p><p>　　表3-5 驗證實驗的設計及結果</p><p&g

44、t;　　由實驗數據可知，驗證結果與理論值相近，從而說明了前期實驗的合理性。</p><p><b>　　4 結論</b></p><p>　　本實驗主要從碳源、氮源、氨基酸、無機鹽離子幾個方面對產紅色素的沙雷氏菌的培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件進行了研究，尋找出影響較大的因素進行了進一步的PLACKETT-BURMAN實驗，找出了影響靈菌紅素產量的兩個主要因素：蛋白胨及NaCl，

45、并發(fā)現了PO43-對靈菌紅素合成的強烈抑制作用。并在PB實驗中發(fā)現了優(yōu)于現有發(fā)酵培養(yǎng)基的配方，在現有基礎上進一步提升了靈菌紅素產量。具體配方如下（g/L）：蛋白胨20，甘露醇12，MgSO4 1.2，NaCl 2.0，Gly 1.5，搖瓶裝液量50 mL/250mL(V/V)，接種量5％(V/V)，pH 5.7，培養(yǎng)溫度28℃，搖床轉速170r/min，培養(yǎng)72h，比優(yōu)化前紅色素的產量提高42.85%。</p><p

46、><b>　　參考文獻</b></p><p>　　[1]劉同軍,楊海龍,唐華.靈菌紅素的研究進展[J].食品與藥物.2007,9(08)47-50.</p><p>　　[2]袁保紅,杜青平,蔡創(chuàng)華,等.海洋細菌Pseudomonas sp.色素的提取及穩(wěn)定性的研究.海洋通報[J],2005,6(24):92-96.</p><p>　

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