高效液相色譜法測(cè)定人血漿中全反式維甲酸血藥濃度

1、<p>　　高效液相色譜法測(cè)定人血漿中全反式維甲酸血藥濃度</p><p>　　【關(guān)鍵詞】 血藥濃度 </p><p>　　摘要:目的 建立高效液相色譜法測(cè)定人血漿中全反式維甲酸濃度。方法 色譜柱為Supelcosil LC18DB柱（5 μm,4.6 mm×250 mm）；流動(dòng)相為甲醇水冰乙酸(體積比82∶17∶1)；柱溫為室溫；流速1.5 mL&#1253

2、9;min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)為340 nm。結(jié)果 全反式維甲酸血藥質(zhì)量濃度在10～1000 ng&#12539;mL-1范圍內(nèi)，與峰面積比有良好的線性關(guān)系（r=0.9997），最低檢測(cè)濃度為2.5 ng&#12539;mL-1。平均方法回收率為（94.5±4.7）%（n=15）。日內(nèi)RSD≤4.1%，日間RSD≤6.2%。結(jié)論 本方法簡(jiǎn)單、快速、靈敏、重現(xiàn)性好，適用于全反式維甲酸臨床血藥濃度監(jiān)測(cè)及人體藥代動(dòng)力學(xué)研究

3、。 </p><p>　　關(guān)鍵詞:全反式維甲酸；血藥濃度；高效液相色譜法 </p><p>　　Abstract: Objective To establish a HPLC method for determination of alltrans retinoic acid in human plasma. Methods A Supelcosil LC18DB column (5 μ

4、m,4.6 mm×250 mm) was adopted. Mobile phase was a mixture of methanol,water and glacial acetic acid（82∶17∶1）. The flow rate was 1.5 mL&#12539;min-1. The UV detection wave was 340 nm. ResultsThe assay procedure w

5、as shown to produce linear calibration curves over the range of 10 ng&#12539;mL-1 to 1000 ng&#12539;mL-1 of alltrans retinoic acid in plasma </p><p>　　Key words:alltrans retinoic acid; plasma concent

6、ration; HPLC </p><p>　　全反式維甲酸(alltrans retinoic acid,ATRA) 是維生素A 的天然氧化代謝產(chǎn)物，可抑制白血病細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)白血病細(xì)胞分化成熟，是目前治療急性早幼粒細(xì)胞白血病(APL)的有效藥物。ATRA對(duì)APL初發(fā)患者完全緩解率可達(dá)85％以上，但對(duì)復(fù)發(fā)患者再次應(yīng)用ATRA則效果不佳，其原因可能是ATRA對(duì)參與其代謝的酶活性具有自身誘導(dǎo)作用，持續(xù)用藥導(dǎo)致血藥

7、濃度逐步降低［1］。本文參考文獻(xiàn)［2-4］，建立了一種靈敏、準(zhǔn)確的ATRA血藥濃度HPLC測(cè)定法，旨在為全反式維甲酸臨床血藥濃度監(jiān)測(cè)及人體藥代動(dòng)力學(xué)研究提供測(cè)定方法。 </p><p><b>　　1 材料與方法 </b></p><p><b>　　1.1 儀器 </b></p><p>　　Waters高效液相色譜

8、儀（515型恒流泵，486型紫外檢測(cè)器，Millennium32色譜工作站）；XW―80A旋渦混合器（上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠）；3K18高速冷凍離心機(jī)（Sigma）；高速離心機(jī)（美國(guó)雅培公司TDx儀附件）。 </p><p>　　1.2 藥品與試劑 </p><p>　　ATRA對(duì)照品(Sigma,純度：98％)，阿維A酸（內(nèi)標(biāo)，羅氏公司），甲醇為色譜純?cè)噭?，其余試劑均為分析純?</

9、p><p>　　1.3 色譜條件 </p><p>　　色譜柱為Supelcosil LC18DB柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）；柱溫為室溫。流動(dòng)相：甲醇水冰乙酸（體積比82∶17∶1）；流速1.5 mL&#12539;min-1。檢測(cè)波長(zhǎng)340 nm。 </p><p>　　1.4 血藥濃度測(cè)定法 </p><p&

10、gt;　　1.4.1 ATRA對(duì)照溶液配制 </p><p>　　精密稱取ATRA對(duì)照品適量，以甲醇溶解并定容，制得濃度為100 μg&#12539;mL-1的ATRA儲(chǔ)備液。將ATRA儲(chǔ)備液以甲醇稀釋，配制濃度分別為0.5、1、2.5、5、10、25、50 μg&#12539;mL-1的ATRA對(duì)照溶液。 </p><p>　　1.4.2 內(nèi)標(biāo)液配制 <

11、/p><p>　　取內(nèi)標(biāo)阿維A酸適量，置于100 mL量瓶中，以甲醇溶解并定容，制得濃度為7.5 μg&#12539;mL-1的內(nèi)標(biāo)液。 </p><p>　　1.4.3 樣本處理 </p><p>　　精密吸取血漿樣品1 mL，置10 mL具塞離心試管中，加入內(nèi)標(biāo)溶液20 μL，旋渦混合30 s。加入1 mol&#12539;L-1的HCl溶液5

12、00 μL，漩渦混合30 s，再加入乙酸乙酯3 mL，旋渦混合1 min，4 500 r/min離心5 min。轉(zhuǎn)移上層液至尖底試管中，于37 ℃水浴中氮?dú)饬鞔蹈?。殘?jiān)尤肓鲃?dòng)相200 μL漩渦混合30 s使溶解，10 000 r/min離心5 min，取上清液50 μL進(jìn)樣，記錄色譜圖，以ATRA峰面積（As）與內(nèi)標(biāo)峰面積（Ai）之比代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算ATRA血藥濃度。 </p><p>　　1.4.4 標(biāo)準(zhǔn)曲

13、線 </p><p>　　精密量取空白血漿1 mL，置10 mL具塞離心管中，分別加入不同濃度ATRA對(duì)照溶液20 μL，混勻，使血藥濃度分別為10、20、50、100、200、500、1000 ng&#12539;mL-1。按樣本處理方法操作，以不同濃度ATRA系列溶液的As和Ai來(lái)計(jì)算A（A=As/Ai），以A值為縱坐標(biāo)，ATRA質(zhì)量濃度(ρ)為橫坐標(biāo)進(jìn)行直線回歸。 </p><

14、;p>　　1.4.5 回收率及精密度 </p><p>　　分別于1 mL空白血漿中加入低、中、高3種濃度的ATRA對(duì)照溶液20μL，混勻，使其濃度分別為10、200、1000 ng&#12539;mL-1，按樣本處理方法操作，計(jì)算ATRA血藥濃度，以測(cè)得濃度與配制濃度之比計(jì)算方法回收率。另以甲醇配制相應(yīng)系列濃度的ATRA溶液，不經(jīng)提取直接測(cè)定，以此為標(biāo)準(zhǔn)，將兩組峰面積相比，計(jì)算ATRA萃取回

15、收率。以1 d內(nèi)測(cè)得的ATRA濃度計(jì)算日內(nèi)精密度，以1周內(nèi)5次測(cè)定的ATRA濃度計(jì)算日間精密度。 </p><p><b>　　2 結(jié) 果 </b></p><p>　　2.1 色譜行為 </p><p>　　在上述色譜條件下，ATRA與內(nèi)標(biāo)物及血漿內(nèi)源性物質(zhì)能夠較好分離，ATRA與內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間分別為8.8 min和6.7 min?？瞻籽?/p>

16、漿及血漿樣品色譜圖見(jiàn)圖1。 </p><p>　　2.2 線性范圍 </p><p>　　ATRA血藥質(zhì)量濃度(ρ)在10～1000 ng&#12539;mL-1范圍內(nèi)，與峰面積比(A)有良好線性關(guān)系，其回歸方程為：A=00116ρ+0.0036，r=0.9997。以信噪比S/N=3：1計(jì)，ATRA最低檢測(cè)濃度為2.5 ng&#12539;mL-1。 </p>

17、<p>　　2.3 回收率及精密度 </p><p>　　高、中、低3種濃度的提取回收率分別為（84.6±5.2）%、（81.2±6.3）%、（81.6±4.6）％，平均方法回收率為（94.5±4.7）%（n=15）。3種濃度的日內(nèi)RSD≤4.1%，日間RSD≤6.2%。結(jié)果見(jiàn)表1。表1 回收率及精密度（略） </p><p>&l

18、t;b>　　3 討 論 </b></p><p>　　本文建立了一種靈敏、準(zhǔn)確的ATRA血藥濃度高效液相色譜測(cè)定法，適用于APL病人ATRA 血藥濃度的常規(guī)監(jiān)測(cè)及臨床藥代動(dòng)力學(xué)研究。通過(guò)監(jiān)測(cè)ATRA血藥濃度，可以更好地了解在某些APL病人連續(xù)用藥治療中臨床復(fù)發(fā)及耐藥的原因。 </p><p>　　ATRA化學(xué)性質(zhì)活潑，見(jiàn)光易異構(gòu)化或氧化降解，因此在樣品提取過(guò)程中應(yīng)特別注

19、意避光操作。提取過(guò)程中血漿加入1 mol&#12539;L-1 HCl溶液，使血漿酸化，可提高萃取回收率，乙酸乙酯一步萃取可使萃取回收率達(dá)到80％以上。 </p><p>　　由于ATRA中的羧基可以與色譜柱中的硅醇基等發(fā)生相互作用，導(dǎo)致色譜峰拖尾，在流動(dòng)相中加入1％(ω)醋酸，可抑制這種作用，消除ATRA峰拖尾現(xiàn)象。 </p><p><b>　　參考文獻(xiàn): </

20、b></p><p>　　［1］MUINDI J,FRANLCEL S R,MILLER W H,et al. Continuous treatment with all - trans retinoic acid causes a progressive reduction in plasma drug concentrations: implications for relapse and retino

21、id "resistance" in patients with acute promyelocytic leukemia［J］. Blood,1992,79: 299. </p><p>　　［2］余自成，姚帥，郁人海.高效液相色譜法同時(shí)檢測(cè)人血清中全反式及13-順式維甲酸濃度［J］.藥物分析雜志，2000，20(4):226. </p><p>　?。?］MICHI

22、KO M,HIROKAZU Y, HARUKO,et al. Simultaneous quantification of retinol,retinal,and retinoic acid isomers by highperformance liquid chromatography with a simple gradiation［J］. J Chromatogr B,2001，757: 365. </p>&l