PCV2 ORF2-PPV VP2核酸疫苗的構(gòu)建及豬IFN-γ對(duì)其分子佐劑效應(yīng)的研究.pdf

1、豬細(xì)小病毒( Procine parvovirus，PPV)，屬于細(xì)小病毒科(Parvoviridae)、細(xì)小病毒屬的成員，是引起母豬繁殖障礙（reproductive failure）的主要病原體之一。各種不同類型的豬均可感染，引起母豬發(fā)生流產(chǎn)、胚胎死亡、胎兒畸形、胎兒木乃伊化及不孕等。豬圓環(huán)病毒2型( Porcine Circovirus type2，PCV-2)是豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)的主要病原，臨床表現(xiàn)為進(jìn)行性消瘦

2、，皮膚蒼白或黃疽。目前這兩種傳染病在豬場(chǎng)并發(fā)或繼發(fā)感染現(xiàn)象較為普遍，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，因此，為了預(yù)防和控制這些疾病，安全、高效的疫苗是首要的解決途徑。干擾素-γ(IFN-γ)在免疫調(diào)節(jié)中其重要作用，它能激活巨噬細(xì)胞、上調(diào)MHCI、Ⅱ類分子表達(dá)水平和促進(jìn)抗原提呈，誘導(dǎo)Th細(xì)胞的分化等，被廣泛應(yīng)用于DNA疫苗佐劑的研究中。
　　 本研究將豬圓環(huán)病毒Ⅱ型ORF2的B細(xì)胞表位基因(47-85aa)重組到豬細(xì)小病毒SC-1株V

3、P2基因的N端，構(gòu)建了真核表達(dá)質(zhì)粒pCI-OV。再通過(guò)基因柔性Linker將豬IFN-γ基因定向克隆到該載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒pCI-IOV。將陽(yáng)性真核質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞，采用RT-PCR法和間接免疫熒光法檢測(cè)技術(shù)確定產(chǎn)物的表達(dá)情況；用MTT法檢測(cè)產(chǎn)物的生物活性。結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中既能擴(kuò)增到目的基因，也能檢測(cè)到特異性蛋白的表達(dá)，證實(shí)其表達(dá)蛋白具有顯著的生物學(xué)活性。將重組質(zhì)粒pCI-OV，pCI-IOV，對(duì)照質(zhì)粒pCI

4、-neo，PBS，豬細(xì)小病毒滅活苗，豬圓環(huán)病毒亞單位疫苗通過(guò)肌肉注射免疫小鼠，檢測(cè)小鼠不同時(shí)期的淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化功能，T淋巴細(xì)胞亞群動(dòng)態(tài)變化情況以及PPV，PCV2抗體水平。結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒免疫小鼠后均能刺激機(jī)體產(chǎn)生良好的免疫應(yīng)答，且pCI-IOV免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化功能，CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞的數(shù)量和血清PPV/PCV2抗體的OD值在二免后均高于或顯著高于細(xì)小滅活苗組、圓環(huán)亞單位苗組和pCI-OV對(duì)照組。結(jié)果表明，豬IFN-γ作

5、為細(xì)胞因子佐劑能顯著增強(qiáng)VP2/ORF2核酸疫苗誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答，整體效果高于普通疫苗組。研究結(jié)果為PPV和PCV2新型疫苗的研究提供了數(shù)據(jù)參考。
　　 于一免后24h、7d、14d、21d、28d、35d、49d、及105d采集小鼠的心、肝、脾、肺、腎、肌肉，提取各組織DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。以純化后的組織總DNA為模板，PCR法檢測(cè)質(zhì)粒DNA整合到小鼠細(xì)胞染色體基因組上的可能性，評(píng)價(jià)疫苗的安全性。結(jié)果表明，一免后24h、7d、1