一株海水光合細菌的分離鑒定及在輪蟲增養(yǎng)殖中的應用【畢業(yè)設計】

1、<p><b>　　本科畢業(yè)設計</b></p><p><b>　　（20_ _屆）</b></p><p>　　一株海水光合細菌的分離鑒定及在輪蟲增養(yǎng)殖中的應用</p><p>　　所在學院 </p><p>　　專業(yè)班級

2、 海洋生物資源與環(huán)境 </p><p>　　學生姓名 學號 </p><p>　　指導教師 職稱 </p><p>　　完成日期 年 月 </p><p><b>　　目 錄</

3、b></p><p><b>　　1引言1</b></p><p><b>　　2材料與方法1</b></p><p><b>　　2.1材料1</b></p><p>　　2.1.1樣品來源1</p><p>　　2.1.2培養(yǎng)

4、基與試劑2</p><p>　　2.1.3儀器設備3</p><p><b>　　2.2方法3</b></p><p>　　2.2.1培養(yǎng)物顏色和菌體形態(tài)觀察3</p><p>　　2.2.2活細胞吸收光譜的測定3</p><p>　　2.2.316SrRNA基因序列分析3&

5、lt;/p><p>　　2.2.4生理特性研究5</p><p>　　2.2.5海水光合細菌對褶皺臂尾輪蟲增養(yǎng)殖的研究6</p><p><b>　　3結果與分析7</b></p><p>　　3.1菌體及菌落形態(tài)特征7</p><p>　　3.2活細胞吸收光譜7</p>

6、;<p>　　3.3菌株cp3 的分子鑒定9</p><p>　　3.4菌株cp3的生理生化特性9</p><p>　　3.4.1碳源利用9</p><p>　　3.4.2氮源利用9</p><p>　　3.4.3初始pH 值對所分離菌株生長的影響10</p><p>　　3.4.4鹽

7、度對菌株生長的影響11</p><p>　　3.4.5光照與氧氣對菌株生長的影響11</p><p>　　3.4.6生長因子利用11</p><p>　　3.4.7無機電子供體12</p><p>　　3.4.8生長曲線的測定12</p><p>　　3.5菌株cp3在褶皺臂尾輪蟲增養(yǎng)殖的應用13&

8、lt;/p><p>　　3.5.1輪蟲形態(tài)特征13</p><p>　　3.5.2菌株cp3投放實驗13</p><p><b>　　4討論14</b></p><p>　　4.1菌株的單菌落分離14</p><p>　　4.2菌株的生理生化特性14</p><

9、p>　　4.3關于影響菌株的條件15</p><p>　　4.4關于菌種鑒定15</p><p>　　4.5關于海水光合細菌在輪蟲增養(yǎng)殖中的應用15</p><p><b>　　致謝16</b></p><p><b>　　參考文獻16</b></p><p

10、>　　摘要：我們從浙江寧海東壩養(yǎng)殖場海水養(yǎng)殖塘的泥樣中分離到一株海水光合細菌，實驗室編號為菌株cp3，我們對菌株cp3做了生物學特性的研究，分析了它的分離純化、細胞形態(tài)、培養(yǎng)特征、活細胞吸收光譜、生理生化特性和16S rRNA基因測序及系統(tǒng)學分析等一系列生物學特性，同時研究了其作用于輪蟲培養(yǎng)時對輪蟲增養(yǎng)殖的影響。研究結果表明：cp3為革蘭氏陰性菌，它具有較廣的適鹽性和耐酸堿特性，厭氧比好氧條件下更適合其生長，菌株cp3的細胞為卵圓

11、形，大小為1.0～1.5μm × 2.2～2.9μm, 厭氧下液體培養(yǎng)物呈紅色，最適生長pH 6.0 ，最適鹽度2％，cp3能利用S、Na2S、Na2S2O3作為硫電子供體。16S rRNA 基因序列測定結果表明菌株cp3與Ectothiorhodospira shaposhnikovii的相似性水平達99.7％，但是某些形態(tài)及生理特征與其不符，可能是新種。在輪蟲培養(yǎng)液中，用一定量光合細菌離心后的菌體作為添加劑，發(fā)現(xiàn)菌株cp3

12、能在2-4天內增加輪蟲增殖率。因此，在輪蟲培養(yǎng)的特定時期加入光合細菌，有助于輪蟲的高密度增養(yǎng)殖的實現(xiàn)。</p><p>　　關鍵詞：光合細菌；革蘭氏陰性菌；16S rRNA；輪蟲；增養(yǎng)殖</p><p>　　Abstract: We isolated one strain of marine photosynthesis bacterium from sediment of ponds i

13、n DongBa Farm in Ninghai, Zhejiang Province. We call it strain cp3. The article studied its purification, morphological, cultural characteristics, absorption spectra, physiological and biochemical characteristics, 16S rR

14、NA gene sequence and its application in proliferation of rotifer. The result shows strain cp3 is Gram-negative bacterium, and possesses comparatively extensive salt and pH adaptability. Gr</p><p>　　Keywords:

15、 photosynthetic bacterium; Gram-negative bacterium; 16SrRNA; rotifer; proliferation</p><p><b>　　1引言</b></p><p>　　光合細菌簡稱PSB，是地球上最早出現(xiàn)的具有原始光能合成體系的原核生物[1]。光合細菌屬于水圈微生物的一種，光合細菌廣泛分布于地球生物圈的各

16、處，無論是海洋、湖泊、江河，還是水田、池塘、沼澤、污泥、氧化池、硫磺泉、土壤、極地，甚至在90℃ 的溫泉中、在300℃ 的鹽湖里、在深達2000m的深海、在南極冰封的海岸上，都能找到其蹤跡。他們在全球水系統(tǒng)中的廣泛分布突出了他們在水生食物鏈和生物地球化學元素循環(huán)以及與環(huán)境間共同進化中的角色[2]。PSB 均為革蘭氏陰性細菌，一般為球型、卵形、桿形、弧形、螺旋形、環(huán)形、半環(huán)形絲形，也可隨培養(yǎng)條件和生長階段而改變，大部分單個存在[3]。&l

17、t;/p><p>　　光合細菌根據(jù)它們所含光合色素和電子供體的不同分為不產氧光合細菌（Anoxyphotosynthetic Bacteria）和產氧光合細菌（Oxyphotosynthetic Bacteria），是地球上最早出現(xiàn)的具有原始光能合成體系的原核生物[4]。產氧光合細菌即藍細菌，能夠像植物一樣，利用光合作用產生氧氣；不產氧光合細菌，即狹義光合細菌，包括厭氧光合細菌（Anaerobic Photosynt

18、hetic Bacteria，APB）和最近提出的好氧不產氧光合細菌（Aerobic Anoxygenic Photosynthetic Bacteria，AAPB）。根據(jù)《伯杰氏細菌鑒定手冊》第九版，不產氧光合細菌被分成七大類群[2,5]：著色菌科（Chromatiaceae）、外硫紅螺菌科（Ectothiorhodospiraceae）、紫色非硫細菌（Purple Nonsulfur Bacteria，簡稱PNSB）、綠硫細菌（Ch

19、lorobiaceae）、多細胞絲狀綠細菌（Multicellular Filamentous，又稱綠色非硫細菌）、螺旋桿菌（Haliobacteriaceae）</p><p>　　光合細菌菌體蛋白質含量在60%以上，而且富含B族維生素、氨基酸和促生長因子，是優(yōu)質的營養(yǎng)型飼料添加劑[6,7]；光合細菌可以直接用來處理高濃度有機廢水，不產生污泥處理問題，所需費用較低[8,9]；光合細菌既是一種優(yōu)質的生物肥料，又能

20、增強植物的抗病能力 [10]；同時在保健食品方面，光合細菌也有很多的應用 [11,12]；PSB菌體無毒，營養(yǎng)非常豐富，是一類營養(yǎng)成分高且種類比較全的微生物，作為水產養(yǎng)殖生物的飼料添加劑，具有明顯的增產效果[13]。輪蟲在以一定濃度的小球藻為餌培養(yǎng)時，在恒溫25 ℃的條件下，光合細菌添加濃度為250ppm 時輪蟲的日平均增殖率最高[14]。</p><p>　　褶皺臂尾輪蟲是一種半咸水的濾食性浮游動物，多以細菌、

21、浮游藻類及小型原生動物和有機碎屑為食。作為魚、蝦類幼體的開口餌料，其適口性、可得性、營養(yǎng)價值及飼養(yǎng)效果均優(yōu)于其它餌料，而且適應力強，生長快，繁殖迅速，培養(yǎng)成本低，極易在生產實踐中推廣利用。褶皺臂尾輪蟲的高密度培養(yǎng)是水產養(yǎng)殖魚、蝦育苗成功與否的關鍵。褶皺臂尾輪蟲的大規(guī)模、高密度培養(yǎng)的環(huán)境條件要求與褶皺臂尾輪蟲的生理需求相一致，否則培養(yǎng)的褶皺臂尾輪蟲將會增殖不良、密度低、營養(yǎng)價值低、甚至逐漸死亡。</p><p>　

22、　本文對一株海水光合細菌的細胞形態(tài)、培養(yǎng)特征、活細胞吸收光譜、生理生化特性以及16S rRNA 基因序列等進行分析。針對目前國內的研究情況以及生產上的需要，利用微生物制劑在科學領域方面獲得的巨大成效，從輪蟲培養(yǎng)中的殘餌、糞便等代謝產物出發(fā)，進行研究，充分利用本來想方設法要去除的有害物質，變廢為寶，把海水光合細菌應用于褶皺臂尾輪蟲的增養(yǎng)殖，希望為水產養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展提供有價值的材料及理論依據(jù)。</p><p><

23、b>　　2材料與方法</b></p><p><b>　　2.1 材料</b></p><p>　　2.1.1 樣品來源</p><p>　　菌種cp3來自寧波大學生命科學與生物工程學院“應用海洋生物技術”教育部重點實驗室光合細菌資源（浙江寧海東壩養(yǎng)殖場海水養(yǎng)殖塘的泥樣中得到）。實驗用到的褶皺臂尾輪蟲采于寧波象山高泥育苗場。&

24、lt;/p><p>　　樣品的采集按照《海洋調查規(guī)范》[15]的要求進行。應用采泥器采集表層泥樣，取泥樣1g于螺口厭氧管中，加滅過菌的液體培養(yǎng)基至滿，擰上螺口帽，混勻。帶回實驗室，放入32℃ 光照強度3000-5000 lux的培養(yǎng)箱培養(yǎng)。光下培養(yǎng)約5-15 天，待有紅色、粉色、黃色或褐色生長物明顯生長后，再連續(xù)轉接多次以求培養(yǎng)液中光合細菌占優(yōu)勢，待進一步分離。</p><p>　　2.1.2

25、 培養(yǎng)基與試劑</p><p>　　a. AT基礎培養(yǎng)基（表1），稍作修改（參照Imhoff JF(1992)）：</p><p>　　表1 AT基礎培養(yǎng)基配方</p><p>　　Tab.1 AT basal medium formulation</p><p>　　注: （1）維生素母液成分（mg/100mL）：生物素Biotin 10

26、，煙酸Niacin 35，鹽酸硫胺素Thiamine dichloride 30，對氨基苯甲酸 Aminobenzo acid 20，鹽酸吡哆胺 Pyridoxolium hydrochloride 10，泛酸鈣 Ca-panthothenate 10，Vitamin B12 5。</p><p>　　（2）微量元素母液成分（mg/L）：FeCl2?4H2O 1800，CoCl2?6H2O 250

27、，NiCl2?6H2O 10，CuCl2?2H2O 10，MnCl2?4H2O 70，ZnCl2 100，H3BO3 500，Na2MoO4?2H2O 30，Na2SeO3?5H2O 10。</p><p>　　（3）磷酸緩沖液成分（g/L）：KH2PO4 68,K2HPO4 114。磷酸緩沖液需單獨滅菌，用前加，以免高溫滅菌時產生沉淀。</p><p>　?。?）半固體加

28、4 g瓊脂。</p><p>　?。?）AT基礎培養(yǎng)基加入2.5%-3%的氯化鈉，用于培養(yǎng)海水樣品。</p><p>　　b. DNA提取試劑</p><p>　?。?）1×TE溶液（pH8.0）；</p><p>　?。?）50 mg/mL溶菌酶；</p><p>　?。?）20% SDS溶液（十二烷基硫酸

29、鈉）；</p><p>　?。?）酚/氯仿/異戊醇溶液（25:24:1,v/v）；</p><p>　?。?）氯仿/異戊醇溶液（24：1，v/v）；</p><p>　?。?）70%乙醇溶液；</p><p>　?。?）3 mol/L NaAc溶液；</p><p><b>　?。?）異丙醇。</b&g

30、t;</p><p>　　c. PCR相關試劑</p><p>　　超純水；10×PCR-buffer；dNTP；Taq酶（Takara）；模板DNA。</p><p>　　d. 瓊脂糖膠回收DNA試劑：</p><p>　　Binding Buffer Ⅱ；Wash Solution；無菌水。</p><p&g

31、t;　　2.1.3 儀器設備</p><p><b>　　a.設備</b></p><p>　　SP-DJ系列水平凈化工作臺；HVE-50型高壓滅菌鍋；RXZ-300B人工氣候箱；UV～2102PC型紫外可見分光光度計（UNICO）；FR復日紫外/可見光分析生物凝膠成像系統(tǒng)；日本奧林巴斯BX-60光學顯微鏡；CX31RTSF系統(tǒng)生物顯微鏡；eppendorf PCR

32、擴增儀； DHG-9123AS型干燥箱；VORTEX振蕩器；微波爐；電泳槽；SL202N電子分析天平；梅特勒～托利多（AL104）電子天平；DK—8D型電熱恒溫水槽；</p><p><b>　　b. 儀器</b></p><p>　　厭氧管、普通玻璃試管、試劑瓶、1.5 ml EP管、PCR管、移液槍、針管、錐形瓶、量筒、燒杯、玻棒、鑷子、記號筆、酒精燈、廢物缸等。

33、</p><p><b>　　2.2 方法</b></p><p>　　2.2.1 培養(yǎng)物顏色和菌體形態(tài)觀察</p><p>　　2.2.1.1 菌落形態(tài)</p><p>　?。?）將cp3活化菌液以生理鹽水逐級稀釋成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8八個梯度，分別取10-5、

34、10-6、10-7、10-8的稀釋液0.1ml注入20ml厭氧管的半固體AT培養(yǎng)基中培養(yǎng)（加有硫化鈉），待有菌落產生。</p><p>　　（2）肉眼觀察菌落的顏色以及其他形態(tài)特征。</p><p>　　2.2.1.2 菌體形態(tài)</p><p>　　取cp3單菌落活化，待其到指數(shù)生長期時進行觀察。</p><p>　　（1）肉眼觀察其液體培養(yǎng)

35、物顏色。</p><p>　?。?）用結晶紫簡單染色，用日本奧林巴斯BX-60光學顯微鏡觀察菌體的形態(tài)、大小。</p><p>　　2.2.2 活細胞吸收光譜的測定</p><p>　　采用AT基礎培養(yǎng)基，對菌株cp3進行培養(yǎng)，取對數(shù)生長期的培養(yǎng)物進行活細胞吸收光譜的測定，離心洗滌后，懸浮于質量分數(shù)60%的蔗糖溶液中，用UV-3100 PC 型紫外分光光度計在300

36、～900 nm波長連續(xù)掃描[16 ] ，記錄其光吸收峰值[17]。</p><p>　　2.2.3 16SrRNA基因序列分析</p><p>　　2.2.3.1 細菌DNA的提取 </p><p>　　(1)1.5 mlEp管收集菌體，離心8000 rpm，5min</p><p>　　(2)用一定體積的1×TE溶液將菌細

37、胞懸浮，混勻</p><p>　　(3)在菌懸液中加入溶菌酶至終濃度2 mg/ml， 緩慢來回顛倒，充分混勻，37℃水浴40 min，每隔3－5 min上下來回緩慢混勻</p><p>　　(4)然后加SDS溶液至終濃度2% ，上下顛倒，充分混勻，60℃水浴約2 h，每隔一段時間觀察液體粘稠度及細胞破壁情況</p><p>　　(5)加入等體積的酚/氯仿/異戊醇溶液

38、(25:24:1，v/v)，上下顛倒混勻，4℃， 12000 rpm離心，10min</p><p>　　(6)取上清液于新管，并重復上一步驟，直至水相澄清為止</p><p>　　(7)取上清夜，加等體積的氯仿/異戊醇溶液(24:1，v/v)，充分搖勻， 4℃離心12000 rpm，10 min</p><p>　　(8)取上清液加1/20體積的NaAc溶液， 再

39、加2倍體積的異丙醇，上下顛倒，充分混勻</p><p>　　(9) 4℃離心12000 rpm，10 min</p><p>　　(10)倒掉上清液，倒扣于紙上吸干，加70%乙醇，離心8 min</p><p>　　(11)倒掉上清液，待酒精完全風干，加入一定體積的純水[18]</p><p>　　2.2.3.2 PCR反應</p>

40、;<p>　　應用細菌通用性引物（27 f-1541 r）PCR擴增試驗細菌的16S rRNA基因全序列</p><p><b>　　(1)引物：</b></p><p>　　27f : AGAGTTTGATCCTGGCTCAG Tm:57.8℃</p><p>　　1541r: ACGGCTACCTTG

41、TTACGACT Tm:57.8℃</p><p>　　(2)50μl PCR反應體系：</p><p>　　10×buffer ：5μl ；引物1：5μl ；引物2：5μl ；dNTP：5μl ；</p><p>　　Taq酶：0.5μl ；模板DNA ：1μl ；純水：49μl ；</p><p>　　(3)

42、PCR反應循環(huán)參數(shù)：</p><p>　?、?4℃，預變性3 min</p><p>　?、?4℃，1 min，60℃， 1 min，72℃，1 min，[1 cycle]</p><p>　?、?4℃，1 min，59℃， 1 min，72℃，1 min，[1 cycle]</p><p>　?、?4℃，1 min，58℃， 1 min，7

43、2℃，1 min，[1 cycle]</p><p>　?、?4℃，1 min，57℃， 1 min，72℃，1 min，[1 cycle]</p><p>　?、?4℃，1 min，56℃， 1 min，72℃，1 min，[1 cycle]</p><p>　?、?4℃，1 min，55℃， 1 min，72℃，1 min，[25 cycles]</p&g

44、t;<p>　?、?2℃，延伸3 min。</p><p>　　2.2.3.3 瓊脂糖凝膠電泳</p><p>　　取15 μl PCR產物進行0.8%的瓊脂糖凝膠電泳，30 min 后觀察結果，然后利用FR復日紫外/可見光分析生物凝膠成像系統(tǒng)進行拍照。</p><p>　　2.2.3.4 瓊脂糖凝膠中回收DNA片段</p><p&

45、gt;　　(1)用滅過菌的手術刀割下含所要回收DNA的瓊脂塊，將放入1.5 ml離心管中</p><p>　　(2)加400μl Binding Buffer Ⅱ，混勻后放置于55℃水浴中約10分鐘，使膠徹底融化</p><p>　　(3)融化的膠溶液轉移到UNIQ-10 柱，放入2.0mlCollection Tube，室溫下放置2 min，然后8000 rpm室溫下離心1min<

46、/p><p>　　(4)棄去廢液，加入500μl Wash Solution，10000 rpm室溫下離心30s</p><p>　　(5)重復步驟（4）一次</p><p>　　(6)棄去廢液，10000 rpm室溫下離心30s，以除去殘留的Wash Solution</p><p>　　(7)將柱子放入新的干凈的1.5 ml離心管中，加入30

47、μl無菌水，室溫下放置2 min</p><p>　　(8)10000 rpm室溫下離心1min，收集管中的液體即為回收的DNA片段。</p><p>　　2.2.3.5 細菌16S rRNA基因序列的測定</p><p>　　送上海生物工程技術公司進行序列測定，獲得菌株16S rDNA 序列。 </p><p>　　2.2.3.6 細菌16

48、S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育學分析</p><p>　　將所得序列用BLAST程序在GenBank 數(shù)據(jù)庫中進行相似性搜索，從中獲取相近的典型菌株16S rDNA 序列，用Clustal X程序進行序列對排，將相似性低的序列登錄Genbank數(shù)據(jù)庫，隨后采用Neighbor-Joining法[19]構建系統(tǒng)進化樹。</p><p>　　2.2.4 生理特性研究</p><

49、p>　　2.2.4.1 碳源利用實驗</p><p>　　在除去碳源（丁二酸鈉、醋酸鈉、酵母膏）的培養(yǎng)基中，分別添加各種碳源[20,21]，所加碳源量見表（表2）。滅菌后，以1 mL菌液/25 mL培養(yǎng)液的接種量接種，光照厭氧30℃下培養(yǎng)。每天觀察菌液變化，待菌生長后測其OD值（λ=660 nm）。</p><p>　　表2 碳源實驗需加碳的含量</p><p&g

50、t;　　Tab.2 content of the carbon source</p><p>　　2.2.4.2 氮源利用實驗</p><p>　　在除去氮源（氯化銨、酵母膏）的培養(yǎng)基中，分別添加以終濃度為0.1%（W/V）尿素、硝酸鈉、亞硝酸鈉、谷氨酸鈉[22]，以及氮氣（N2：培養(yǎng)基＝1：1），滅菌，以1 mL菌液/25 mL培養(yǎng)液的接種量接種，光照厭氧30℃下培養(yǎng)。每天觀察其菌液變化

51、，待菌生長后測其OD值(λ=660 nm)。</p><p>　　2.2.4.3 pH值實驗</p><p>　　采用AT液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)基滅菌后，用1mol/L鹽酸和1mol/L氫氧化鈉將 pH值調至 5.5，6.0，6.7，7.9，9.0，以1 mL菌液/25 mL培養(yǎng)液的接種量接種，光照厭氧30℃下培養(yǎng)，分別在第三天和第七天測定其OD值(λ=660 nm)。</p>&

52、lt;p>　　2.2.4.4 鹽度實驗</p><p>　　采用AT液體培養(yǎng)基，其他成分不變，NaCl質量濃度分別為0％，1%，2%，3%，5%。培養(yǎng)基滅菌后，以1 mL菌液/25 mL培養(yǎng)液的接種量接種，光照厭氧30℃下培養(yǎng)，分別在第三天和第七天測定其OD值(λ=660 nm)。</p><p>　　2.2.4.5 光照與氧氣實驗</p><p>　　采用A

53、T液體培養(yǎng)基，分別置于光照厭氧、黑暗厭氧、光照有氧、黑暗有氧條件下培養(yǎng)，分別在第三天和第七天測定其OD值(λ=660 nm)。厭氧－培養(yǎng)基充滿厭氧管， 有氧－厭氧管中留有一半空氣。</p><p>　　2.2.4.6必需生長因子實驗</p><p>　　在除去維生素的培養(yǎng)基中分別如表3加入生長因子，滅菌后以1 mL菌液/25 mL培養(yǎng)液的接種量接種，光照厭氧30℃下培養(yǎng)。第五天測其OD值(

54、λ=660 nm)。</p><p>　　表3生長因子實驗－生長因子種類及含量</p><p>　　Tab.3 Test of growth factor－types and content of growth factors</p><p>　　2.2.4.7 無機電子供體實驗</p><p>　　硫化物無機電子供體利用的測定是在原先的培養(yǎng)

55、基中加入終濃度分別為0.1%（W/V）S、5 mmol/L Na2S2O3 、0.5 mmol/L Na2SO3 和1 mmol/L Na2S·9H2O，觀察其利用狀況。先將Na2S配成母液，過濾除菌，然后注射入滅過菌的厭氧管中。</p><p>　　2.2.4.8 生長曲線的測定</p><p>　　取活化后的菌液接種到液體培養(yǎng)基，每隔12h取樣稀釋4倍后用紫外可見分光光度計（

56、UV-3100PC型）在660 nm 處測定吸光值，并用血球計數(shù)板記錄菌體個數(shù)，連續(xù)測定6天，依吸光度值作光合細菌的生長曲線。</p><p>　　2.2.5海水光合細菌對褶皺臂尾輪蟲增養(yǎng)殖的應用研究</p><p>　　2.2.5.1 生長動力學研究</p><p>　　用小球藻與面包酵母作為餌料培褶皺臂尾輪蟲，進行實驗室輪蟲馴化。對褶皺臂尾輪蟲進行預培養(yǎng)，初步握

57、褶皺臂尾輪蟲的基本生長規(guī)律，在光學顯微鏡下觀察輪蟲的形態(tài)結構。實驗中用到的褶皺臂尾輪蟲采于寧波象山高泥育苗場；小球藻來自于寧波大學藻種室，用滅菌海水加小球藻3號營養(yǎng)液進行實驗室培養(yǎng)；面包酵母取于高泥育苗場，用300目紗布過濾到盛有海水的燒杯中，取過濾得到的溶解液投喂輪蟲。血球計數(shù)板計數(shù)小球藻濃度約為8×10 6/ml。</p><p>　　2.2.5.2 菌株cp3投放實驗</p><

58、;p>　　實驗中添加的光合細菌cp3取于生長旺盛期（光照培養(yǎng)下第3天）的cp3培養(yǎng)液，OD值約為0.75，8000r/min條件下常溫離心3分鐘，棄去上清液，保留菌體。</p><p>　　取12個500ml錐形瓶，分為6組，每組設兩個平行，分別標記為0a、0b、1a、1b、2a、2b、3a、3b、4a、4b、6a、6b。取定量原輪蟲培養(yǎng)液，加入新鮮海水稀釋、混勻，用1ml移液管吸取1ml對輪蟲進行計數(shù)，約

59、12個/mL。裝于12個錐形瓶，每個錐形瓶分裝300ml。各組分別加入0、1、2、3、4、6ml光合細菌培養(yǎng)液離心后的菌體。置于小室窗臺，保持溫度在25℃（空調）左右。每天早8點和晚8點投喂小球藻和面包酵母，每天在早晨8點投喂前對輪蟲進行計數(shù)（計數(shù)前搖勻）。</p><p><b>　　3結果與分析</b></p><p>　　3.1 菌體及菌落形態(tài)特征</p&

60、gt;<p>　　Cp3菌體形態(tài)與菌落形態(tài)詳見下表（表4）： </p><p>　　表4 菌株形態(tài)及基本特征</p><p>　　Tab.4 Basic Characteristics of cp3</p><p>　　菌體形態(tài)顯微圖見圖1。</p><p>　　圖1 cp3-100×光鏡照片</p>

61、<p>　　Fig.1 cp3-100×The light micrograph</p><p>　　3.2 活細胞吸收光譜</p><p>　　菌株cp3活細胞經紫外可見分光光度計連續(xù)掃描(見圖2)，可以看出：cp3在375-382nm，585-596nm、798-806nm、830-890 nm都出現(xiàn)最大吸收峰，表明此菌株含有細菌葉綠素a；Cp3在490nm，520

62、-534 nm附近出現(xiàn)最大吸收峰，表明有正常螺菌紅質系的類胡蘿卜素存在。</p><p>　　圖2 cp3的吸收光譜圖</p><p>　　Fig.2 Absorption spectrum of live cell suspension of cp3</p><p>　　圖3菌株cp3的系統(tǒng)進化樹</p><p>　　Fig.3 Neig

63、hbor-joining tree of cp3</p><p>　　3.3 菌株cp3 的分子鑒定</p><p>　　用NCBI的BLAST功能將菌株cp3的16S rRNA基因序列與GenBank 中已登錄的基因序列做比對，然后通過RDP下載相關標準菌株序列，再利用EBI程序進行cp3與標準菌株的序列比對。</p><p>　　測序結果表明，菌株cp3與外硫紅

64、螺菌外硫紅螺旋菌屬(Ectothiorhodospira)的Ectothiorhodospira shaposhnikovii的16S rRNA 基因序列相似性達到99.7%。</p><p>　　通過進化樹來判斷某個種或屬的細菌在漫長的進化過程中所處的地位，選取相似種屬內所有種和科間屬外的一些種來分析cp3的進化地位。具體進化關系見上圖（圖3）。</p><p>　　3.4 菌株cp3的

65、生理生化特征</p><p><b>　　3.41碳源利用</b></p><p>　　碳源等基質利用試驗是光合細菌分類鑒定上的重要鑒別特征，可作為種屬精確鑒定的重要依據(jù)[ 23,24] 。</p><p>　　碳源利用結果(表5)表明：菌株cp3在乙酸鈉、檸檬酸鈉、丁二酸鈉為碳源的培養(yǎng)基上可以生長，相對于正常培養(yǎng)基乙酸鈉，在丁二酸鈉下可以較好

66、的生長，檸檬酸鈉下生長緩慢，且生長得不好，在其余培養(yǎng)基上基本不能生長。</p><p>　　表5 菌株cp3對碳源的利用情況</p><p>　　Tab.5 Utilization of carbon source of strain cp3</p><p>　　3.4.2 氮源利用</p><p>　　不同氮源實驗結果表明：</p&

67、gt;<p>　　菌株cp3只在N2、NH4Cl培養(yǎng)基上生長，而NH4Cl培養(yǎng)基上生長相對較好，在不加氮源的培養(yǎng)基上幾乎不能生長，說明它的生長需氮源。</p><p>　　表6 菌株cp3對氮源的利用情況</p><p>　　Tab.6 Utilization of nitrogen source of strain cp3</p><p>　　注：

68、 “+”表示該培養(yǎng)基上細菌能夠生長(OD660≈0.10～0.20)，“++”表示該培養(yǎng)基上細菌生長較好(OD660≥0.20)“-”表示不能生長</p><p>　　3.4.3 初始pH值對所分離菌株生長的影響</p><p>　　培養(yǎng)基的pH的改變會影響培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質的離子化程度，從而影響微生物對營養(yǎng)物質的吸收利用，而且還會影響微生物代謝反應中各種酶的活性。微生物在其生命活動過程中，

69、也會分泌胞外產物，改變外界環(huán)境的pH，以適應自身的生長[25]。</p><p>　　圖4的結果顯示，菌株cp3屬于耐酸堿菌種，適宜生長的pH范圍比較廣，pH5.5～8.0下均能生長，其最適pH為6.0。</p><p>　　圖4　pH對菌株cp3生長的影響</p><p>　　Fig.4　Effect of pH on the growth of strain c

70、p3</p><p>　　表7的結果表明，cp3在光照厭氧環(huán)境下培養(yǎng)一段時間(5天)后，培養(yǎng)液的pH值會升高。這可能由于光合細菌在生長代謝過程中釋放出了堿性代謝物， 也可能是由于光合細菌選擇利用了酸性基團的營養(yǎng)成分，從而使堿性基團殘留，pH升高[26]。</p><p>　　表7 菌株cp3 pH的變化</p><p>　　Tab 7 The change of

71、pH of strain cp3</p><p>　　3.4.4 鹽度對菌株生長的影響</p><p>　　由圖5可知，菌株cp3在鹽度≥5％時，幾乎不生長；在0％-4%的鹽度下都能生長；在1%—3%生長的很好， 2%為最適生長鹽度。因此，菌株cp3的生長對鹽度的要求不高，可以在較大范圍鹽度內生長。</p><p>　　圖5　鹽度對菌株cp3生長的影響</p&

72、gt;<p>　　Fig.5　Effect of NaCl concentration on the growth of strain cp3</p><p>　　3.4.5 光照與氧氣對菌株生長的影響</p><p>　　實驗結果（表8）表明，cp3不能在黑暗的條件下生長，光照厭氧條件下cp3的生長比光照好氧條件下要好，說明此株菌均為兼性厭氧菌。</p>&l

73、t;p>　　表8 光照與氧氣對菌株cp3生長的影響</p><p>　　Tab.8 Effect of light and oxygen on the growth of strain cp3</p><p>　　注：“- ”表示不生長，“+”表示該培養(yǎng)基上細菌能夠生長，“++”表示該培養(yǎng)基上細菌生長較好</p><p>　　3.4.6 生長因子利用</

74、p><p>　　實驗結果表明（表9），cp3在缺乏任何一種維生素的培養(yǎng)基中均能較好生長，菌株cp3在缺乏對氨基苯甲酸的情況下生長最好。在缺乏另外幾種維生素的培養(yǎng)基中菌株的生長情況比添加全部維生素的培養(yǎng)基中的好， 這可能是由于培養(yǎng)基中添加的各種維生素的量過多抑制了菌的生長，所以在培養(yǎng)基時維生素的加量可以適當減少。</p><p>　　表9 菌株cp3對生長因子的利用情況</p>

75、<p>　　Tab.9 Utilization of growth factors of strain cp3</p><p>　　注：“+”表示該培養(yǎng)基上細菌能夠生長，“++”表示該培養(yǎng)基上細菌生長較好，“+++”表示該培養(yǎng)基上細菌生長良好</p><p>　　3.4.7 無機電子供體</p><p>　　光合作用過程中厭氧光合細菌通常使用硫化物或其他還

76、原性硫化合物以及氫分子或有機小分子等作為電子供體[27]。通過菌株cp3對硫化物的利用（表10）可知，菌株cp3能利用S、Na2S2O3 和Na2S·9H2O，不能利用Na2SO3。</p><p>　　表10 無機電子供體對菌株cp3生長的影響</p><p>　　Tab.10 Effect of Inorganic electron donors on the growth

77、of strain cp3</p><p>　　注：“- ”表示不生長，“+”表示該培養(yǎng)基上細菌能夠生長，“+++”表示該培養(yǎng)基上細菌生長良好</p><p>　　3.4.8 生長曲線的測定</p><p>　　以細菌660nm波長下的OD值為橫坐標，以菌體數(shù)量為縱坐標，做出菌株cp3菌體數(shù)與OD值的關系圖（圖6）。從圖中得到，光合細菌菌株cp3的菌體數(shù)量與OD值大

78、小呈線性關系?？梢杂霉統(tǒng)=6×107x+1×106此公式來表示，x為OD值，y即為此OD值下的菌體數(shù)量。</p><p>　　圖6 Cp3菌體數(shù)量與OD值大小的關系</p><p>　　Fig.6 the relationship between bacterial numbers and the the OD values of Cp3</p><

79、;p>　　以OD值與培養(yǎng)時間的關系作cp3的生長曲線圖(圖7)。菌株cp3在24 h左右進入對數(shù)生長期，48 h后生長速率放緩，細菌總量達到最大值，達到光合細菌生長的穩(wěn)定期。</p><p>　　圖7光合細菌菌株cp3的生長曲線</p><p>　　Fig.7 Photosynthesis Bacteria strain cp3 growth curve</p><

80、;p>　　3.5 菌株cp3在褶皺臂尾輪蟲增養(yǎng)殖的應用</p><p>　　3.5.1 輪蟲形態(tài)特征</p><p>　　用1ml移液管吸取搖勻的培養(yǎng)液，對光觀察，肉眼可以觀察到生長良好的褶皺臂尾輪蟲游動活潑，趨光性強。在顯微鏡下觀察則個體肥大，胃腸飽滿，多數(shù)成體帶夏卵，一般3-4個。生長不良者則多數(shù)不帶卵或帶冬卵，出現(xiàn)雄體，死殼增多，活力減弱等現(xiàn)象。</p><

81、p>　　3.5.2 菌株cp3投放實驗</p><p>　　計數(shù)：每天早晚8點從攪勻的培養(yǎng)液中取含有褶皺臂尾輪蟲的培養(yǎng)液lmL，在日光下進行計數(shù)，輪蟲個數(shù)以飽滿游動白色個體為準，每次計數(shù)重復三次，最后求出每毫升褶皺臂尾輪蟲數(shù)的平均值。</p><p>　　分析：對計數(shù)結果進行統(tǒng)計分析，得到圖8</p><p><b>　　圖8輪蟲生長趨勢</b

82、></p><p>　　Fig.8 Trend of rotifer growth</p><p>　　可以看出，第三組中輪蟲增殖率在光合細菌投入后的2到4天內含量與其他組相比要高，但是后期逐漸各組趨于同一值，這可能是由于水體其他環(huán)境因素及營養(yǎng)條件的限制。</p><p>　　取培養(yǎng)第3天的生長旺盛的cp3菌株，其培養(yǎng)液OD為0.75，由生長曲線得到光合細菌濃

83、度約為4.6×107 個/ml。當cp3加量為3ml時，輪蟲增殖率最高。此時，初始培養(yǎng)液中cp3濃度約為4.6×105個/ml。</p><p><b>　　4討論</b></p><p>　　4.1 Cp3的單菌落分離</p><p>　　通常光合細菌菌株的單菌落采用普通的半固體分離方法就可以得到，但是 cp3菌株無法得到

84、理想的單菌落，通過一系列分離方法最后在半固體培養(yǎng)基中加入Na2S才能分離得到理想的單菌落。我們推測cp3菌株可能是由于分離出來的單菌落菌株缺少了某種電子供體而不能生長，而cp3菌系中的某些雜菌剛好為其提供了它所需的電子供體，而分離以后的純菌株需要H2S作為電子供體才能生長，因此需要加入Na2S才能得到cp3的單菌落。</p><p>　　4.2 Cp3的生理生化特征</p><p>　　從

85、上述實驗分析，株菌cp3的細胞壁革蘭氏染色為陰性，具有較廣的適鹽性和耐酸堿性，在去除一切有機碳源的情況下不能利用碳酸氫鈉自養(yǎng)生長，黑暗不能生長，厭氧比好氧更適合其生長，可較好地利用乙酸鹽、丁酸鹽為碳源，不嚴格需要任何一種維生素。菌株cp3的細胞為卵圓形，大小為1.0～1.5μm × 2.2～2.9μm, 厭氧液體培養(yǎng)物呈紅色，細胞含有螺菌紅質系的類胡蘿卜素及細菌葉綠素a，最適生長pH為6.0 ,最適鹽度2％，cp3還能利用S、

86、Na2S、Na2S2O3作為硫電子供體。</p><p>　　4.3 關于影響菌株的條件</p><p>　　由該實驗可知，培養(yǎng)基的鹽度、初始pH、光照或黑暗、有氧或無氧對菌體生長有很大影響，而在發(fā)酵生產中，培養(yǎng)條件的優(yōu)劣直接影響生產效率和成本，培養(yǎng)條件的最優(yōu)化是成功進行菌體生產的必要條件[28]。此外，接種量、溫度、攪拌、光照強度等對菌的生長也有很大影響，因此仍需進行實驗，以完善菌株的最

87、佳生長條件參數(shù)，進一步為菌株的規(guī)?；囵B(yǎng)及工業(yè)化應用提供理論參考。</p><p>　　4.4 關于菌種鑒定</p><p>　　目前大部分科學家認為單純依靠16S rRNA基因序列同源性這一指標不足以將菌株鑒定到種[29-31]，光合細菌菌株的鑒定嚴格來講需要采用傳統(tǒng)的形態(tài)學特征、生理生化特征，結合核酸的堿基組成[(G+C)％]，分子雜交等分子生物學手段，才能準確鑒定到種。</p&

88、gt;<p>　　以伯杰士細菌系統(tǒng)學手冊第二版為依據(jù)，16S rDNA 基因序列測定和其他生物學特征的結果比較，菌株cp3與外硫紅螺菌屬的特征描述有許多不同，如菌株cp3的菌體形態(tài)為卵圓形，最適鹽度為2%，最適pH為6.0；而外硫紅螺菌屬各菌的菌體形態(tài)并沒有卵圓形，沙氏外硫紅螺菌的最適鹽度和最適pH分別為3%和8.0等，因此該種有可能是新種，對此有待更深入的實驗驗證。而該菌的分類地位有待進一步確定。</p>

89、<p>　　4.5 關于海水光合細菌在輪蟲增養(yǎng)殖中的應用</p><p>　　輪蟲增殖的主要因素為餌料、氧、氨氮的積累和殘餌、糞便等代謝產物。在輪蟲培養(yǎng)中，隨著種群密度的增大，輪蟲分泌和水中有機質分解產生的氨將積累到相當濃度，并產生明顯的毒性，這些懸浮物有機質還會堵塞回收輪蟲用的浮游生物網(wǎng)，不僅阻礙輪蟲的回收和清洗，而且伴隨著這些輪蟲的投喂，還成為了仔、稚魚疾病的病因。這些有機質更成為細菌的營養(yǎng)源而繁殖

90、出大量的以弧菌、不動桿菌、黃桿菌、產堿桿菌、霍亂菌、巴氏桿菌、水中產氣單胞菌等為優(yōu)勢菌的菌群，嚴重影響了輪蟲的培養(yǎng)，更使輪蟲的品質下降。</p><p>　　目前國內外把提高輪蟲培養(yǎng)的密度、生產力和生產效率的研究重心放在了水處理裝置的開發(fā)上，投入了大量的資金來去除輪蟲培養(yǎng)中的殘餌、糞便等代謝產物，未能充分利用這些大量可以利用的有機質。光合細菌具有多種生理功能，代謝類型極為多樣，有光能自養(yǎng)、異養(yǎng)和混養(yǎng)多種營養(yǎng)生長方

91、式，具有光合、固碳、降解大分子有機物、固氮、脫氮、硝化、反硝化、硫化物氧化等代謝方式，被廣泛應用于有機污水的處理和改善養(yǎng)殖水體環(huán)境等，也是許多動物的優(yōu)質餌料。海水光合細菌cp3菌株作用于褶皺臂尾輪蟲時，能在2-4天內增加其繁殖力，因此在輪蟲培養(yǎng)的特定時期添加光合細菌有助于輪蟲高密度增養(yǎng)殖的實現(xiàn)，對解決現(xiàn)實中輪蟲培養(yǎng)密度低、抱卵率不高的問題有很大幫助。</p><p>　　本次研究選取了具有代表性的菌株cp3，研究

92、了其特性及對輪蟲培養(yǎng)的作用。各光合細菌菌株的生物學特性研究是一個很耗時的過程，且輪蟲的培養(yǎng)有一定的水溫、光照等因素的控制，由于時間及季節(jié)關系，并未對其余各個菌株及其混合菌株對輪蟲培養(yǎng)的影響進行研究。如果對各種光合細菌作用于輪蟲培養(yǎng)的影響做較為徹底、全面的研究，選擇合適的光合細菌和確定合適的菌液添加劑量，形成優(yōu)勢菌群，以消耗殘餌、糞便等代謝產物，減少氨氮的產生并消耗產生的氨氮。在消耗這些阻礙輪蟲培養(yǎng)的物質的同時，產生的菌體作為輪蟲的優(yōu)質餌

93、料，以使輪蟲培養(yǎng)過程中密度、生產力和生產效率都有明顯的提高，這對于解決現(xiàn)實問題有很大的應用前景。</p><p><b>　　參考文獻</b></p><p>　　張德民. 紫色非硫細菌多相分類及分子生態(tài)學研究[M]. 博士論文, 1998.</p><p>　　Yong hui Zeng, Wei Shen, Nianzhi Jiao. Ge

94、netic diversity of aerobic anoxygentic photosynthetic bacteria in open ocean surface waters and upper twilighe zones[J]. Mar Biol, 2009, 156: 425-437.</p><p>　　魏玉利. 光合細菌的培養(yǎng)及應用[J]. 生命科學儀器, 2007, (3): 27-30.&l

95、t;/p><p>　　沈萍. 微生物學[M] . 北京:高等教育出版社, 2000.</p><p>　　Hugenholtz Philip,Pitulle Christian et al. Novel dicision level bacterial diversity in a Yellowstone hot spring[J]. Bacteriol, 1998, 180(2): 366-

96、376.</p><p>　　黃穎穎, 陳春娜, 周云帆. 光合細菌在水產養(yǎng)殖上的應用性研究成果[J].江西飼料, 2007, 1: 16-17.</p><p>　　李彥芹, 闞振榮, 康現(xiàn)江. 微生態(tài)制劑及其在水產動物養(yǎng)殖中的作用[M].蝦類養(yǎng)殖研究. 北京:海洋出版社, 2002: 85-88.</p><p>　　龍思思, 謝數(shù)濤, 段舜山. 光合細菌及其應

97、用現(xiàn)狀[J].生態(tài)科學, 2002, 21(1): 91-94.</p><p>　　何劍丹. 光合細菌處理生活污水和垃圾滲濾液的研究[D]. 四川師范大學, 2005.</p><p>　　刁治民, 李長慧. 光合細菌的營養(yǎng)價值及開發(fā)應用前景[J]. 青海草業(yè), 2001, 10(1): 36-39.</p><p>　　熊琦, 張肇銘. 光合細菌增強高脂大鼠抗氧

98、化能力的初步研究[J]. 山西大學學報:自然科學版, 2002, 25 (3) : 249.</p><p>　　Toda, Yoshimoto, Kudo. Purp le photosynthetic bacteria and health foods: EP, 1172434; A I, 020116 [P]. 2002 - 01 - 16.</p><p>　　崔戰(zhàn)利. 光合細菌的

99、基本特性及應用價值[J]. 黑龍江八一農墾大學學報, 1999, 11(1): 20-25.</p><p>　　王鑒, 祝國芹. 不同濃度的光合細菌對輪蟲繁殖的影響. 水產科學, 2004.</p><p>　　國家海洋局. 海洋調查規(guī)范[M]. 北京: 海洋出版社, 1975.</p><p>　　徐姍楠, 邱宏端, 林娟等. 紫色非硫光合細菌的分離鑒定及其功能

100、研究[ J ]. 福州大學學報:自然科學版, 2004, 32 (2) : 246 - 251.</p><p>　　楊素萍, 張肇銘, 趙春貴. 綠色紅假單胞菌和綠硫紅假單胞菌的分離與鑒定[J].微生物學報, 1995, 35(2): 91-96.</p><p>　　Li L, Kato C, Horikoshi K. Microbial Diversity in Sediments

101、Collected from the Deepest Cold-Seep Area, the Japan Trench [J]. Biodivers. Conserv, 1999, 8:659-677.</p><p>　　Saitou N, Nei M. The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees

102、 [J]. Mol. Biol. Evol, 1997, 4:406-425. </p><p>　　沈錦玉, 劉問, 尹文林等. 光合細菌HZBSP 菌株的分離鑒定及其生長特性的測定[J]. 科技通報, 2005, 21(1): 69-73.</p><p>　　周洪波, 劉飛飛, 邱冠周. 一株光合細菌的分離鑒定及污水處理能力研究[J]. 生態(tài)環(huán)境, 2006, 15(5): 901-

103、904.</p><p>　　楊素萍, 連建科, 趙春貴等. 含奧氏酮嗜鹽紫色硫細菌的分離鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析[J].微生物學報, 2008, 48(5): 571-576.</p><p>　　朱章玉, 俞吉安, 林志新,等. 光合細菌的研究及應用[M]. 上海: 上海交通大學出版社, 1991.</p><p>　　東秀珠, 蔡妙英. 常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊[M].

104、 北京: 科學出版社, 2002. 9- 42; 349- 418.</p><p>　　吳韶菊. 海藻希瓦氏菌產河豚毒素的初步研究[D]. 中國海洋大學,2005.</p><p>　　唐亮, 鄭杰華, 徐姍楠. 環(huán)境因素對光合細菌應用培養(yǎng)過程增殖的影響[J]. 福州大學學報(自然科學版), 2003, 31(2): 253-256.</p><p>　　Laur

105、ie A Achenbach, Jennifer Carey, Michael T Madigan. Photosynthetic and Phylogenetic Primers for Detection of Anoxygentic Phototrophs in Natural Environments[J]. Applied and Environment Microbiology, July 2001, p.2922-2926

106、.</p><p>　　潘連德, 陳輝. 藥物防治的臨床藥理學與水產藥物學問題[J].水產科技情報, 1998,25(4): 169－173.</p><p>　　Yamamoto S, Harayama S. PCR amplification and direct sequencing of gyrB genes with universal primers and their app

107、lication to the detection and taxonomic analysis of Pseudomonas putida strains[J]. Appl Environ Microbiol, 1995, 61 : 1104 – 11091.</p><p>　　Satomi M, Oilawa H, Yano Y. Shewanella marinintestina sp.nov. , Sh

108、ewanella schlegeliana sp. nov. and Shewanella sairae sp.nov. , novel eicosapentaenoic-acid-producing marine bacteria isolated from sea-animal intestines[J]. Int J Syst Evol Microbiol, 2003, 53: 491 – 4991.</p><