下調(diào)血管生成素對(duì)人膀胱癌t24細(xì)胞增殖,凋亡的影響

1、<p>　　下調(diào)血管生成素對(duì)人膀胱癌T24細(xì)胞增殖、凋亡的影響</p><p>　　舒 靜，田文琳，李 林，劉玉林，陳俊霞 (400016 重慶，重慶醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)與遺傳學(xué)教研室，分子醫(yī)學(xué)與腫瘤研究中心)</p><p>　?。壅?目的 構(gòu)建人血管生成素(angiogenin，ANG)基因siRNA干擾質(zhì)粒，檢測(cè)其對(duì)膀胱癌T24細(xì)胞增殖、凋亡的影響。方

2、法 將針對(duì)人ANG基因siRNA表達(dá)質(zhì)粒和無(wú)同源性的對(duì)照質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染T24細(xì)胞后經(jīng)G418篩選出陽(yáng)性克隆。根據(jù)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒不同分為3組：T24組(未轉(zhuǎn)染組)、T24-NC組(轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照質(zhì)粒組)、T24-siANG組(轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒組)。通過(guò)RT-PCR檢測(cè)T24細(xì)胞中ANG的mRNA表達(dá)水平，Western blot檢測(cè)ANG蛋白的表達(dá)；MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖活力；流式細(xì)胞術(shù)、TUNEL及Hochest(33342)檢測(cè)細(xì)胞凋亡；Wester

3、n blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax及Caspase-3的表達(dá)；構(gòu)建移植瘤模型，組織HE染色和免疫熒光CD31檢測(cè)微血管變化；組織免疫化學(xué)方法檢測(cè)移植瘤中ANG、Bax、Caspase-3、Bcl-2的表達(dá)。結(jié)果 酶切和測(cè)序結(jié)果證明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功；T24-siANG組ANG的mRNA水平及蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）；T24-siANG組細(xì)胞增殖活力明顯下降（P＜0.05）；流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示：與T2</p

4、><p>　?。坳P(guān)鍵詞］ 血管生成素；膀胱癌；增殖；凋亡</p><p>　　[中圖法分類號(hào)] [文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A</p><p>　　Effect of down-regulation human angiogenin on proliferation and apoptosis in h

5、uman bladder cancer T24 cells</p><p>　　Shu Jing ,Tian Wenlin, Li Lin ,Liu Yulin ,Chen Junxia (Dapartment of Cell Biology and Genetics ,Molecular Medicine and Cancer Research Center ,College of Basic Medical

6、Science ,Chongqing Medical University, Chongqing, 400016,China)</p><p>　?。跘bstract］ Objective To determine the effects of down-regulation angiogenin on proliferation, apoptosis in human bladder cancer T24

7、cells. Methods One siRNA vectors specific to ANG gene and one non-homologous negative control were designed and constructed, then transfected into bladder cancer T24 cells with Lipofectamine 2000, and the positive clones

8、 were screened by G418, respectively, and were named as T24-siANG, T24-NC.T24 cells without transfection were named as control (T24 group). The ex</p><p>　?。跭ey words］ angiogenin; bladder cancer; proliferati

9、on ;apoptosis</p><p>　　Supported by the National Natural Science Foundation of China (81372203).Corresponding author: Chen Junxia, Tel:86-23-68485806, E-mail:chjunxia@126.com</p><p>　　血管生成素（angi

10、ogenin，ANG）是1985年由美國(guó)哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院Fett等首次從人結(jié)腸腺癌HT-29細(xì)胞系培養(yǎng)基的上清中分離純化的小分子蛋白質(zhì)。ANG是一種多功能的重要堿性分泌蛋白，與胰核糖核酸酶（pancreatic ribonucleases）的序列有35％的同源性，能激活胞外蛋白酶系統(tǒng)及介導(dǎo)細(xì)胞粘附、活化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，促進(jìn)rRNA轉(zhuǎn)錄和核轉(zhuǎn)移［1］。研究表明［2］，ANG的表達(dá)和活性在前列腺癌、肺癌等多種惡性腫瘤中均有升高，然而目前通過(guò)下調(diào)

11、ANG的表達(dá)影響膀胱癌T24細(xì)胞凋亡的研究，國(guó)內(nèi)外少見(jiàn)報(bào)道。</p><p>　　為了進(jìn)一步探討ANG的功能，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)RNA干擾技術(shù)下調(diào)膀胱癌T24細(xì)胞ANG的表達(dá)，并探討ANG表達(dá)下調(diào)對(duì)凋亡關(guān)鍵蛋白（Bcl-2、Bax及Caspase-3）表達(dá)及細(xì)胞增殖、凋亡的影響，為膀胱癌的治療提供新的思路。</p><p><b>　　1 材料與方法</b></p>

12、;<p>　　1.1 主要試劑及動(dòng)物</p><p>　　RPMI1640培養(yǎng)基、標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清購(gòu)于天津?yàn)?TBD)公司；質(zhì)粒抽提純化試劑盒、Trizol試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、2×TaqMix、SalⅠ等購(gòu)于大連寶生物公司；轉(zhuǎn)染試劑盒Lipofectamine 2000購(gòu)于Invitrogen公司；TUNEL凋亡檢測(cè)試劑盒、Hochest33342試劑購(gòu)自Biyotime生物技術(shù)公司；AN

13、G抗體（兔抗人）購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；Bcl-2、Bax、Casepase-3、β-actin購(gòu)自美國(guó)Bioworld公司；人膀胱癌細(xì)胞株T24、質(zhì)粒pGenesil-1來(lái)自本實(shí)驗(yàn)保存。BALB/c裸鼠4～6周，體質(zhì)量（20±3）g，購(gòu)于北京大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。</p><p><b>　　1.2 方法</b></p><p>　　1.2.1 T

14、24-siANG干擾質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 根據(jù)GenBank提供人ANG基因的cDNA序列（NM_001097577），應(yīng)用Ambion在線軟件設(shè)計(jì)出小干擾RNA(siRNA)和一條與任何基因均無(wú)同源性的陰性對(duì)照組序列分別命名為T24-siANG1、T24-siANG2。T24-siANG1正義鏈：5′-GATCCGGAATGGAAACCCTCACAGATTCAAGAGATCTGTGAGGGTTTCCATTCTTTTTTGTCGACA

15、-3′,反義鏈：5′-AGCTTGTCGACAAAAAAGAATGGAAACCCTCACAGATCTCTTGAATCTGTGAGGGTTTCCATTCCG-3′；T24-siANG2陰性對(duì)照正義鏈：5′-GATCCGCGCAGAAAACGAGACACGAGATTCAAGAGATCTCGTGTCTCGTTTTCTGCGTTTTTTGTCGACA-3′，反義鏈：5′-AGCTTGTCGACAAAAAACGCAGAAAACGAGACACGAG

16、ATCTCTTGAATCTCGTGTCTCGTTTTCTGCGCG-3′。然后分別在上游5′和3′端引入</p><p>　　1.2.2 人膀胱癌T24細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染</p><p>　　1.2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 用含10%的標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清培養(yǎng)基培養(yǎng)（37℃、5%CO2）T24細(xì)胞。</p><p>　　1.2.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與分組 取對(duì)數(shù)期細(xì)胞接種于6

17、孔板中培養(yǎng)，細(xì)胞數(shù)量達(dá)70%～80%用Lipofectamine 2000分別轉(zhuǎn)染不同的質(zhì)粒到細(xì)胞。根據(jù)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒不同分別命名為T24細(xì)胞組(未轉(zhuǎn)染組)、T24-NC組(轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照質(zhì)粒組)、T24-siANG組(轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒組)。</p><p>　　1.2.3 篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染ANG的細(xì)胞株 陰性對(duì)照質(zhì)粒、干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染24h后傳代，48h后用400µg/mL G418篩選，14d后采用有限稀釋法挑選

18、綠色熒光團(tuán)接種于24孔板培養(yǎng)和96孔板。10～14d后消化單克隆細(xì)胞團(tuán)、擴(kuò)大培養(yǎng)。</p><p>　　1.2.4 各組細(xì)胞ANG基因表達(dá)的檢測(cè)</p><p>　　1.2.4.1 RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞ANG的mRNA表達(dá)水平 Trizol試劑盒提取各組細(xì)胞總mRNA，RT-PCR試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞ANG的表達(dá)量。ANG基因上游引物：5′-CAGCACTATGATGCCAAACC

19、AC-3′，下游引物：5′-GAAATGGAAGGCAAGGACAGC-3′；GAPDH基因上游引物：5′-GCTGTCCCTGTCGCCTCTG-3′，下游引物：5′-TGCCGATGGTGATGACCTGG-3′。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變形5min，95℃30s，60℃30s，72℃90s，30個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)2％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后、凝膠成像儀顯影，Quantity One分析ANG與β-actin相對(duì)強(qiáng)度比值。</p>

20、;<p>　　1.2.4.2 Western blot 檢測(cè)ANG蛋白的表達(dá) 提取各組穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的總蛋白，經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳，濕轉(zhuǎn)至PVDF膜，5％脫脂奶粉封閉2h，一抗4℃孵育過(guò)夜（ANG 1∶100，β-actin 1∶2000）；HRP標(biāo)記的羊抗兔（1∶2000）二抗常溫孵育2h，ECL發(fā)光顯色并進(jìn)行ANG與β-actin相對(duì)強(qiáng)度的比值分析。</p><p>　　1.2.5

21、MTT檢測(cè)T24細(xì)胞的增殖 將對(duì)數(shù)期各組細(xì)胞，以2×103/孔接種于96孔培養(yǎng)板，每組設(shè)8個(gè)復(fù)孔進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)24、48、72、96、120h后，加MTT溶液20μL/孔并繼續(xù)培養(yǎng)4h，去除培養(yǎng)基，加150μL DMSO/孔，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀檢測(cè)490nm波長(zhǎng)下各孔光密度值[D（490）]。細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率=[1-實(shí)驗(yàn)組D（490）值/對(duì)照組D（490）值]×100％。</p><p&

22、gt;　　1.2.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期各組穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，胰酶消化，PBS洗3次，70％乙醇4℃固定2h，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。</p><p>　　1.2.7 TUNEL檢測(cè)細(xì)胞凋亡 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各組細(xì)胞，每孔2×106 細(xì)胞接種于放有蓋玻片的6孔板，細(xì)胞融合度達(dá)70％，PBS洗3次，4％多聚甲醛固定1h，0.1％ Triton X-100 通透5 min；每組加入

23、50μL TUNEL檢測(cè)液，37℃避光孵育1h，PBS洗3次，甘油封片后熒光顯微鏡觀察拍照。</p><p>　　1.2.8 Hochest33342檢測(cè)細(xì)胞凋亡 各組以2×106細(xì)胞接種于放有蓋玻片的6孔板中，細(xì)胞融合度達(dá)70％，PBS洗3次，4％多聚甲醛固定1h，PBS洗3次，每個(gè)樣品孔加入150μL 按比例稀釋后的Hochest檢測(cè)液，37℃避光孵育30min，PBS洗3次，甘油封片后熒光顯

24、微鏡觀察拍照。</p><p>　　1.2.9 Western blot檢測(cè)細(xì)胞Bcl-2、Bax及Caspase-3蛋白的表達(dá) 蛋白裂解液提取各組細(xì)胞總蛋白，12％SDS-PAGE 凝膠電泳，常規(guī)濕法轉(zhuǎn)膜，5％脫脂奶粉封閉2h，一抗4℃孵育過(guò)夜[Bcl-2，Bax，Caspase-3（1∶150），β-actin（1∶2000）]；HRP標(biāo)記的羊抗兔（1∶2000）二抗常溫孵育2h，ECL發(fā)光顯色并進(jìn)行A

25、NG與β-actin相對(duì)強(qiáng)度的比值分析。</p><p>　　1.2.10 動(dòng)物水平檢測(cè)下調(diào)ANG對(duì)T24細(xì)胞凋亡蛋白的影響</p><p>　　1.2.10.1 動(dòng)物移植瘤模型 收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，用無(wú)血培養(yǎng)基制備2×107/mL 細(xì)胞懸液，分別皮下注射BALB/c裸鼠0.1 mL，每組8只。記錄各組腫瘤形成時(shí)間，6周后處死裸鼠，取腫瘤組織并固定于4％多聚甲醛溶液中。<

26、/p><p>　　1.2.10.2 HE染色 10%甲醛溶液固定腫瘤組織，5μm切片，二甲苯、梯度乙醇脫蠟至水，自來(lái)水沖洗，二甲苯和純酒精(1:1)混合液中浸泡5min，經(jīng)梯度酒精浸泡各5min，蘇木精染色3min，1%鹽酸酒精分色數(shù)秒，流水沖洗，蒸餾水清洗3次，伊紅染色3min，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片，顯微鏡下觀察并拍照。</p><p>　　1.2.10.3 組織免疫

27、熒光檢測(cè)血管CD31 腫瘤組織經(jīng)冰凍切片后，4％多聚甲醛溶液固定15min，PBS洗3次，0.1％Triton X-100通透10min，PBS洗3次，0.03％雙氧水封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶20min，1％BSA封閉30min，一抗兔抗人（CD31 1∶100）4℃孵育過(guò)夜，PBS洗3次，滴加Fluorescein標(biāo)記的羊抗兔二抗，37℃孵育30min，PBS洗3次，50％甘油封片，熒光顯微鏡觀察拍片。</p><

28、;p>　　1.2.10.4 免疫組織化學(xué)觀察各組移植瘤中ANG、Bax、Caspase-3及Bcl-2的表達(dá) 取固定于4％多聚甲醛溶液的腫瘤組織，石蠟包埋，5μm切片，二甲苯、梯度乙醇脫蠟至水，自來(lái)水沖洗，PBS洗3次，3％過(guò)氧化氫滅活過(guò)氧化物酶，PBS洗3次，枸櫞酸鈉修復(fù)抗原，PBS洗3次，5％羊血清封閉，一抗（ANG 1∶50，Caspase-3 1:200，Bax及Bcl-2均1:100）4℃孵育過(guò)夜，PBS洗3次，滴

29、加生物素化山羊抗兔，37℃孵育30min，PBS洗3次，滴加鏈霉素抗生素-過(guò)氧化物酶溶液37℃孵育20min，PBS洗3次，DAB顯色，復(fù)染，晾干，中性樹(shù)脂封片，觀察拍片。</p><p><b>　　1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析</b></p><p>　　采用SPSS 11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x±s表示，配對(duì)組間比較采用t檢驗(yàn)、多組間比較采用方差分析。

30、</p><p><b>　　2 結(jié)果</b></p><p>　　2.1 ANG基因siRNA重組質(zhì)粒酶切和測(cè)序鑒定</p><p>　　重組質(zhì)粒被Sal Ⅰ單酶切為400bp與4400bp左右的2個(gè)片段，證明人ANG基因已成功插入到載體中；測(cè)序結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒的目的序列與設(shè)計(jì)的寡核苷酸序列一致，表明重組質(zhì)粒鑒定正確。見(jiàn)圖1。</p&

31、gt;<p>　　M1 M2 1 2 3 4 5</p><p>　　M1:標(biāo)準(zhǔn)（10000bp ladder）；M2:標(biāo)準(zhǔn)（1000bp ladder）；1:pGenesil-1質(zhì)粒；2：pGenesil-1 siRNA-1質(zhì)粒；3：pGenesil-1 siRNA-1質(zhì)粒酶切；4：pGenesil-1 siRNA-2陰性對(duì)照質(zhì)粒；5：pGenesil-1 siRNA-

32、2陰性對(duì)照質(zhì)粒酶切</p><p>　　圖1 酶切鑒定檢測(cè)結(jié)果</p><p>　　2.2 ANG siRNA 在各組T24細(xì)胞中的表達(dá)</p><p>　　2.2.1 T24細(xì)胞ANG mRNA的表達(dá)水平 與T24-NC組(0.75±0.04)和T24組(0.71±0.06)相比,T24-siANG 組(0.44±0.07)

33、細(xì)胞的ANG mRNA表達(dá)分別降低了41%和38%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而對(duì)照組間無(wú)明顯差異（P＞0.05）。見(jiàn)圖2。</p><p>　　M 1 2 3 4 5 6</p><p>　　M：標(biāo)準(zhǔn)（1000bp ladder）；1、2：T24-siANG組；3、4：T24-NC組；5、6：T24組；1、3、5：ANG mRNA；2、4、6：GAP

34、DH mRNA</p><p>　　圖2 RT-PCR檢測(cè)ANG mRNA的表達(dá)</p><p>　　2.2.2 T24細(xì)胞ANG蛋白表達(dá) 與T24-NC組和T24組相比，T24-siANG組的ANG蛋白表達(dá)降低了45%和49%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），而兩對(duì)照組間無(wú)明顯差異（P＞0.05）。見(jiàn)圖3。</p><p>　　1：T24-siANG組

35、；2：T24-NC組；3：T24組</p><p>　　圖3 Western blot 檢測(cè)各組細(xì)胞ANG蛋白的表達(dá)</p><p>　　2.3 各組細(xì)胞增殖活力的變化</p><p>　　T24-siANG細(xì)胞組的D（490）值于接種后第2天開(kāi)始顯著低于T24-NC組和T24組（P＜0.05），接種48、72、96、120h，T24-siANG組細(xì)胞抑制率分別是

36、18％、27％、36％、42％，而對(duì)照組間無(wú)明顯差異（P＞0.05）。見(jiàn)圖4。</p><p>　　a：P＜0.05，與T24-NC 組和T24 組比較</p><p>　　圖4 MTT法檢測(cè)T24細(xì)胞生長(zhǎng)增殖能力</p><p>　　2.4 各組細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果</p><p>　　2.4.1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 T24-siA

37、NG組有（30.23±15.81）％的凋亡細(xì)胞(P＜0.01)，而T24-NC組和T24細(xì)胞組僅有(5.44±3.09)％和(3.96±1.58)％的凋亡細(xì)胞，且兩對(duì)照間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。見(jiàn)圖5。</p><p>　　2.4.2 TUNEL檢測(cè)細(xì)胞凋亡 T24-siANG細(xì)胞組出現(xiàn)大量帶高亮熒光的凋亡細(xì)胞，而T24、T24-NC組僅有少量凋亡細(xì)胞。見(jiàn)圖6。</

38、p><p>　　2.4.3 Hochest33342檢測(cè)細(xì)胞凋亡 T24-siANG 組出現(xiàn)典型的凋亡形態(tài)特征，如染色質(zhì)凝集、核碎裂和明亮的藍(lán)色熒光，而T24-NC組和T24組沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明顯凋亡特征。見(jiàn)圖7。</p><p>　　2.4.4 各組細(xì)胞中Bcl-2、Bax及Caspase-3蛋白的表達(dá) T24-siANG組Bax、Caspase-3蛋白的表達(dá)，分別與T24-NC組和T

39、24組相比，升高了46％和51％（P＜0.01），37％和32％（P＜0.05）；T24-siANG組Bcl-2蛋白表達(dá)分別與T24-NC組和T24組相比，降低了38％和41％（P＜0.05），而兩對(duì)照間均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。見(jiàn)圖8。</p><p>　　A：T24組；B：T24-NC組；C：T24-siANG組</p><p>　　圖5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率</

40、p><p>　　A：T24組；B：T24-NC組；C：T24-siANG組</p><p>　　圖6 TUNEL檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡</p><p>　　A：T24組；B：T24-NC組；C：T24-siANG組</p><p>　　圖7 Hochest33342檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡</p><p>　　A：Western bl

41、ot檢測(cè)結(jié)果；1：T24組；2：T24-NC組；3：T24-siANG組；B：半定量分析；a：P＜0.05，b：P＜0.01，與T24、T24-NC組比較</p><p>　　圖8 Western blot 檢測(cè)各組細(xì)胞Bax、Caspase-3和Bcl-2蛋白的表達(dá)</p><p>　　2.4.5 ANG基因表達(dá)下調(diào)對(duì)腫瘤微血管生成的影響 與T24-NC組（12.6±2

42、.8）相比，T24-siANG組（3.4±1.2）腫瘤血管生成顯著減少(P＜0.01)。見(jiàn)圖9。</p><p>　　2.4.5 免疫組化檢測(cè)移植瘤中ANG、Bax、Caspase-3及Bcl-2蛋白表達(dá) 與T24-NC組和T24組相比，T24-siANG組ANG蛋白表達(dá)明顯降低，凋亡標(biāo)志性蛋白Bcl-2表達(dá)顯著降低，而B(niǎo)ax、Caspase-3蛋白明顯升高，與Western blot結(jié)果一致。見(jiàn)

43、圖10。</p><p><b>　　箭頭示腫瘤微血管</b></p><p>　　圖9 ANG基因表達(dá)下調(diào)對(duì)腫瘤微血管生成的影響</p><p>　　圖10 免疫組織化學(xué)觀察移植瘤中ANG、Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白的表達(dá)</p><p><b>　　3 討論</b></

44、p><p>　　血管生成素（ANG）是一種促進(jìn)新生血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)的單鏈堿性蛋白，由123個(gè)氨基酸殘基組成，屬于核糖核酸酶超家族成員，具有弱Rnase活性，相對(duì)分子質(zhì)量約為14.4×103，在體內(nèi)外均具有強(qiáng)烈誘發(fā)血管生成的活性。研究發(fā)現(xiàn)[3-4]在不同類型的腫瘤細(xì)胞中血管生成素高表達(dá)，不僅與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、惡化密切相關(guān)，而且對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移、增殖和血管的形成有廣泛的影響。Gao等[5-7]研究發(fā)現(xiàn)，AN

45、G可直接提高癌癥細(xì)胞(Hela細(xì)胞、PC-3細(xì)胞)的擴(kuò)散，對(duì)血管的生成和腫瘤的擴(kuò)散起雙重作用。體外實(shí)驗(yàn)［8］證實(shí)：血管生成素可促進(jìn)平滑肌細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、管腔形成。本研究通過(guò)RNA干擾技術(shù)，有效抑制ANG的mRNA和蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)沉默ANG表達(dá)可抑制細(xì)胞增殖活力，調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，從而誘導(dǎo)T24細(xì)胞凋亡。流式細(xì)胞術(shù)和TUNEL檢測(cè)結(jié)果顯示：T24-siANG組細(xì)胞有大量的凋亡細(xì)胞，而T24-NC組和T24細(xì)胞組僅有少量的

46、凋亡細(xì)胞；Hochest檢測(cè)結(jié)果顯示：T24-siANG組出現(xiàn)典型的凋亡形態(tài)特征，而T24-NC組和T24組沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明顯凋亡特征。</p><p>　　惡性腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)是異常增殖的結(jié)果，細(xì)胞的增殖和血管密度與腫瘤的生長(zhǎng)密切相關(guān)，血管生成是腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的必要條件，而檢測(cè)腫瘤血管微血管密度(MVD)一般采用CD31、CD34等泛血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物［9］。CD31屬于黏附分子免疫球蛋白超家族的主要成員，主要在血管內(nèi)

47、皮細(xì)胞和血小板上表達(dá)。血小板與腫瘤細(xì)胞相互作用后釋放的活性物質(zhì)，可激活腫瘤細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)合，促使CD31黏附于腫瘤細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞，在腫瘤的血管形成和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用［10］。本實(shí)驗(yàn)將siRNA ANG T24細(xì)胞及對(duì)照組細(xì)胞皮下注射到BALB/c裸鼠中，觀察腫瘤微血管密度的變化以及CD31在腫瘤組織中表達(dá)的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ANG siRNA不僅明顯抑制了腫瘤細(xì)胞血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)增殖，而且顯著降低了CD31的表達(dá)，這可能

48、進(jìn)一步提示siRNA ANG 抑制了腫瘤血管的生成，阻礙膀胱癌T24細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛能，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。同時(shí)大量實(shí)驗(yàn)表明，ANG與CD31表達(dá)呈正相關(guān)，CD31表達(dá)的高低與腫瘤分級(jí)、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，抑制ANG的表達(dá)能夠降低血管微血管的形成以及多種類型的腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移潛能［11］。</p><p>　　細(xì)胞凋亡是為了維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，涉及多基因參與與控制，引起細(xì)胞自主有序死亡的過(guò)程，主要以Bcl-2家族調(diào)控介導(dǎo)的凋

49、亡起主要作用，根據(jù)Bcl-2家族蛋白在細(xì)胞的作用劃分為兩類：一類為抗凋亡蛋白（如Bcl-2、Bcl-xl）；另一類為促凋亡蛋白（如Bax、Bid）。文獻(xiàn)報(bào)道[12-14]，Bcl-2蛋白不僅與Bax結(jié)合形成異源二聚體阻斷細(xì)胞色素C的釋放，還引起細(xì)胞核谷胱甘肽的聚集和核內(nèi)氧化還原平衡的改變，從而降低Caspase-3的活性，抑制下游Caspase-3的激活，達(dá)到有效抑制細(xì)胞凋亡的作用。此外研究發(fā)現(xiàn)[15-16]，異常表達(dá)的Bcl-2可以使

50、過(guò)度增生區(qū)及癌變區(qū)的細(xì)胞生命延長(zhǎng)；而B(niǎo)ax蛋白通過(guò)與線粒體膜直接結(jié)合，釋放細(xì)胞色素C，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Walensky等［17］研究發(fā)現(xiàn)：當(dāng)下調(diào)Bax基因表達(dá)時(shí)，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞生存時(shí)間延長(zhǎng)，促使突變的積累，有利于腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移及侵襲。本研究發(fā)現(xiàn)ANG表達(dá)被沉默后，抑制Bcl-2的表達(dá)，使Bax表達(dá)顯著升高，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。</p><p>　　Caspase-3屬于ICE蛋白酶家族，即含半谷氨酸的天冬氨酸特異水解酶

51、。一方面，在正常細(xì)胞中Caspase-3以無(wú)活性的Caspase-3酶原（pro-Caspase-3）的形式存在，只有當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，才具有活性［18］；另一方面Caspase-3還可水解Bcl-2，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)［19-21］：細(xì)胞凋亡過(guò)程實(shí)際是Caspase不可逆有限水解底物的級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)的過(guò)程，如同凝血因子一樣“瀑布式”層層激活；而啟動(dòng)后的Caspase即可開(kāi)啟細(xì)胞的死亡程序，以異源活化方式水解下游蛋白（如Caspase

52、-3，6）并放大凋亡信號(hào)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示，敲除ANG基因可使活化的Caspase-3表達(dá)顯著升高，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。腫瘤的異種移植模型表明，ANG表達(dá)下調(diào)降低了腫瘤組織中Bcl-2表達(dá)，而增高了Bax、Caspase-3表達(dá)，這可能進(jìn)一步提示siRNA ANG 促進(jìn)了膀胱癌T24細(xì)胞的凋亡。</p><p>　　綜上所述，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證明：ANG基因與膀胱癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖及血管的形成有著密切的聯(lián)系。下調(diào)

53、ANG的表達(dá)，可抑制膀胱癌T24細(xì)胞的增殖活力和微血管生成，調(diào)節(jié)凋亡關(guān)鍵蛋白（Bcl-2、Bax及Caspase-3）的表達(dá)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。為進(jìn)一步研究ANG的生物學(xué)功能和其調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡的分子機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)：</b></p><p>　?。?］Xu Z, Monti D M, Hu G. Angiogenin act

54、ivates human umbilical artery smooth muscle cells[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2001, 285(4):909-914.</p><p>　?。?］Nilsson U W, Abrahamsson A, Dabrosin C. Angiogenin regulation by estradiol in breast tissue

55、: tamoxifen inhibits angiogenin nuclear translocation and antiangiogenin therapy reduces breast cancer growth in vivo[J]. Clin Cancer Res, 2010, 16(14): 3659-3669.</p><p>　　[3］ Yoshioka N, Wang L, Kishimoto

56、K, et al. A therapeutic target for prostate cancer based on angiogenin-stimulated angiogenesis and cancer cell proliferation[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2006, 103(39):14519-14524.</p><p>　?。?］Kim H M, Kang

57、 D K, Kim H Y, et al. Angiogenin-induced protein kinase B/Akt activation is necessary for angiogenesis but is independent of nuclear translocation of angiogenin in HUVE cells[J].Biochem Biophys Res Commun, 2007, 352(2):5

58、09-513.</p><p>　　［5］Gao X, Xu Z. Mechanisms of action of angiogenin[J]. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai), 2008, 40(7):619-624.</p><p>　?。?］Tsuji T, Sun Y, Kishimoto K, et al. Angiogenin is tr

59、anslocated to the nucleus of HeLa cells and is involved in ribosomal RNA transcription and cell proliferation[J]. Cancer Res, 2005, 65(4): 1352-1360.</p><p>　?。?］Li S, Hu G F. Angiogenin-mediated rRNA transc

60、ription in cancer and neurodegeneration[J]. Int J Biochem Mol Biol, 2010, 1(1): 26-35.</p><p>　?。?］Kulka M, Fukuishi N, Metcalfe D D. Human mast cells synthesize and release angiogenin, a member of the ribon

61、uclease A (RNase A) superfamily[J]. J Leukoc Biol, 2009, 86(5):1217-1226.</p><p>　?。?］Jacobs B L, Lee C T, Montie J E. Bladder cancer in 2010: how far have we come?[J]. CA Cancer J Clin, 2010, 60(4):244-272.

62、</p><p>　?。?0］Bazzoni G. Pathobiology of junctional adhesion molecules[J]. Antioxid Redox Signal, 2011, 15(5):1221-1234.</p><p>　?。?1］Ramani P, Headford A, Sowa-Avugrah E, et al. Angiogenin expr

63、ession in human kidneys and Wilms' tumours: relationship with hypoxia and angiogenic factors[J]. Int J Exp Pathol, 2013, 94(2):115-125.</p><p>　?。?2］Hartman M L, Czyz M. Anti-apoptotic proteins on guard

64、of melanoma cell survival[J]. Cancer Lett, 2013, 331(1):24-34.</p><p>　?。?3］Ashkenazi A, Dixit V M. Death receptors: signaling and modulation[J]. Science, 1998, 281(5381):1305-1308.</p><p>　　［14

65、］Vandaele L, Goossens K, Peelman L, et al. mRNA expression of Bcl-2, Bax, caspase-3 and -7 cannot be used as a marker for apoptosis in bovine blastocysts[J]. Animal Reprod Sci, 2008, 106(1/2):168-173.</p><p>

66、;　?。?5］Tomek M, Akiyama T, Dass C R. Role of Bcl-2 in tumour cell survival and implications for pharmacotherapy[J]. J Pharm Pharmacol, 2012, 64(12):1695-1702.</p><p>　　［16］Kuwana T, Mackey M R, Perkins G, et

67、 al. Bid, Bax, and lipids cooperate to form supramolecular openings in the outer mitochondrial membrane[J]. Cell, 2002, 111(3):331-342.</p><p>　?。?7］Walensky L D , Gavathiotis E. BAX unleashed: the biochemic

68、al transformation of an inactive cytosolic monomer into a toxic mitochondrial pore[J]. Trends Biochem Sci, 2011, 36(12):642- 652.</p><p>　?。?8］高娟, 康煒, 陳俊霞, 等. siRNA沉默整合素連接激酶對(duì)人膀胱癌細(xì)胞凋亡的影響[J]. 第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào), 2012, 3

69、4(21): 2154- 2157.</p><p>　　［19］Tiwari M, Lopez-Cruzan M, Morgan W W, et al. Loss of caspase-2-dependent apoptosis induces autophagy after mitochondrial oxidative stress in primary cultures of young adult co

70、rtical neurons[J]. J Biol Chem, 2011, 286(10): 8493- 8506.</p><p>　?。?0］Kim B M, Hong S H. Sequential caspase-2 and caspase-8 activation is essential for saikosaponin a-induced apoptosis of human colon carci

71、noma cell lines[J]. Apoptosis, 2011, 16(2):184- 197.</p><p>　?。?1］Tatsukawa H, Sano T, Fukaya Y, et al. Dual induction of caspase 3- and transglutaminase-dependent apoptosis by acyclic retinoid in hepatocell