應用體內誘導抗原技術篩選仔豬大腸桿菌0139體內表達基因的初步研究.pdf

1、豬致病性大腸桿菌病是對規(guī)?；B(yǎng)豬生產(chǎn)危害較嚴重的傳染性疾病之一，給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大經(jīng)濟損失。一方面，大腸桿菌的血清型復雜，致病性大腸桿菌血清型不斷發(fā)生變化，導致免疫失敗，給豬大腸桿菌病的控制增加了困難。另一方面，由于近年來抗生素的廣泛持續(xù)利不當使用，導致大腸桿菌耐藥株的不斷增多，耐藥機制的不斷變遷，使人們對大腸桿菌病的治療變得十分困難。因此，本研究擬利用體內誘導抗原技術，希望找到一些大腸桿菌的體內誘導基因，并分析它們的功能，從而能進一步了

2、解大腸桿菌病的具體致病機制，為將來發(fā)現(xiàn)新的藥物靶標，研發(fā)新的疫苗和診斷試劑提供一些新的線索。 體內誘導抗原技術(in vivo—induced antigen technology，IVIAT)是快速鑒定體內特異性表達抗原基因的高通量篩檢技術。其原理是利用體外培養(yǎng)的病原微生物去除感染動物血清中針對體外表達抗原的抗體，再用此吸附血清作為探針來篩選病原微生物基因組表達文庫中體內特異性表達抗原的基因，旨在為新藥、新疫苗利新型診斷方法研

3、發(fā)提供新靶標，為進一步闡明病原體致病與免疫機理提供理論依據(jù)。 病原菌感染機體后體內誘導表達的抗原通常與病原菌的致病性機制密切相關。為了研究致病性大腸桿菌感染機體過程中存在的致病因子，本研究采用了體內誘導抗原技術，以致病性大腸桿菌O139為研究對象，對其在體內的表達基因進行了篩選。 首先構建了豬源大腸桿菌O139的基因組表達文庫：提取了豬源大腸桿菌O139的基因組，用限制性內切酶Sau3AI不完全酶切并回收1～4Kb的基因

4、組DNA片段。限制性內切酶BamHI酶切原核表達載體pET-32a(+)，回收線性載體，用CIAP去磷酸化。將上述兩種酶切回收DNA片段進行連接反應，轉化大腸桿菌DH5a，堿裂解法提取重組質粒，用 XhoI和 NcoI雙酶切的方法對提取的重組質粒進行鑒定，鑒定結果達到符合要求。把大量提取的重組質粒直接轉入新鮮制備的感受態(tài)細胞BL21中，計算表達文庫的庫容量，經(jīng)過計算文庫容量為1.2×104，滿足了我們研究工作的需要，之后隨機挑取10個克

5、隆用上述雙酶切方法鑒定文庫．結果顯示隨機挑選的10個克隆都為陽性克隆，酶切后載體片段約為5.9Kb，插入片段基本位于2～4Kb之間。說明大腸桿菌基因組O139的表達文庫構建的比較成功，為進一步篩選大腸桿曲體內誘導基因奠定了良好的基礎。 然后對大腸桿菌基因組表達文庫進行了篩選：收集感染致病性大腸桿菌仔豬的血清，用玻板凝集法檢測仔豬血清抗體，比較符合率，符合率為30％(3/10)，與菌株血清型鑒定一致。用經(jīng)體外培養(yǎng)的大腸桿菌菌株O1