北冬蟲夏草MAT1-1-1基因和甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因(Cmgpd)的克隆和分析.pdf

1、子囊菌(Ascomycetes)是真菌門中最大的一綱,本綱最重要的特征是產(chǎn)生子囊(ascus),內(nèi)生子囊孢子(ascospore)。子囊是兩性核結(jié)合的場所,結(jié)合的核經(jīng)減數(shù)分裂,形成子囊孢子；其有性生殖過程的研究已有80多年。子囊真菌可根據(jù)形態(tài)差異分成兩組：一組是單核酵母,而另一組是絲狀真菌。在所有真菌中,眾所周知的釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)最有經(jīng)濟(jì)價(jià)值,被廣泛用于面包制作、發(fā)酵和釀酒。在絲狀子囊菌中,冬

2、蟲夏草(Cordyceps sinensis)是一種絲狀真菌,在中國已經(jīng)作為一種中藥被廣泛使用了幾個(gè)世紀(jì)。北冬蟲夏草(Cordyceps militaris)作為冬蟲夏草的替代品也是一種蟲生真菌,同樣含有很多生物活性成分,例如蟲草素(3’-脫氧腺苷)、蟲草酸和蟲草多糖等。在本研究中,通過高效液相色譜法(HPLC)和苯酚-硫酸法分別檢測了冬蟲夏草和北冬蟲夏草的各個(gè)部分中蟲草素和蟲草多糖的含量。結(jié)果表明：北冬蟲夏草子實(shí)體中的蟲草素含量為1.

3、137%,北冬蟲夏草菌絲體中的蟲草素含量為0.7162%,冬蟲夏草中的蟲草素含量為0.000523%；北冬蟲夏草子實(shí)體中的蟲草多糖含量為3.35%,北冬蟲夏草菌絲體中的蟲草多糖含量為3.05%,冬蟲夏草中的蟲草多糖含量為7.83%。子囊真菌的菌種改良主要依靠隨機(jī)突變法或經(jīng)典的遺傳育種法,從而篩選出目的特性改良了的突變體或雜交后代。實(shí)驗(yàn)室中真菌交配是遺傳分析和菌種改良的有利工具。在異宗交配的子囊真菌中,典型的交配只能在形態(tài)相同而交配型不同

4、的配偶菌株間進(jìn)行,而交配型可分為MAT1型和MAT2型。通常MAT1型和MAT2型由單個(gè)交配型位點(diǎn)MAT1決定,因?yàn)镸AT1位點(diǎn)上的等位基因沒有相似性,所以這樣的等位基因又被稱為“獨(dú)特型”(idiomorph)。MAT1型和MAT2型的獨(dú)特型分別為MAT1-1和MAT1-2。盡管等位基因MAT1-1和MAT1-2的核苷酸序列相似性很低,但是MAT1-1和MAT1-2的兩端側(cè)翼序列具有高度同源性。子囊真菌的交配型等位基因編碼含已確定或推測

5、的DNA結(jié)合基元的蛋白。這些蛋白作為主要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,控制特異細(xì)胞的形成和有性形態(tài)的形成的途徑。對(duì)于交配型的分子特性的充分理解將能降低菌種育種過程中所需花費(fèi)的勞動(dòng)力。通過基于PCR的交配型測試,證明本實(shí)驗(yàn)室保存的北冬蟲夏草的交配型是MAT1型。雖然已有北冬蟲夏草MAT1-1等位基因的部分DNA序列報(bào)道,但是北冬蟲夏草交配型基因MAT1-1-1的3’端序列仍然是未知的。所以通過熱不對(duì)稱交錯(cuò)PCR(Thermal Asymmetric I

6、nterlaced PCR,TAIL-PCR)技術(shù),擴(kuò)增了北冬蟲夏草的MAT1-1序列全長。結(jié)果表明等位基因MAT1-1上含有兩個(gè)交配型基因MAT1-1-1和MAT1-1-2,但是在MAT1-1-1基因和MAT1-1的3’端側(cè)翼區(qū)域中間,并沒有發(fā)現(xiàn)其它潛在的基因。北冬蟲夏草的交配型位點(diǎn)上的MAT1-1的基因組織結(jié)構(gòu)與另一個(gè)同科蟲生真菌高雄山蟲草(C. takaomontana)相似。另一方面,植物病原真菌瘤座菌屬(Balansia)的菌

7、種,麥角菌(Claviceps purpurea )和稻香柱菌(Epichloe typhina)同屬于麥角菌科,其與蟲草菌科的關(guān)系非常近,然而這些真菌除了含有MAT1-1-1和MAT1-1-2基因外還含有另外一個(gè)交配型基因MAT1-1-3。這些結(jié)果暗示麥角菌科的植物病原真菌可能是蟲草菌科的蟲生真菌的較早的祖先,可能在從植物進(jìn)入動(dòng)物的宿主遷移中丟失了MAT1-1-3基因。甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phos

8、phate dehydrogenase,GPD)基因的啟動(dòng)子被廣泛用于驅(qū)動(dòng)真菌中目的基因的組成型表達(dá)。然而,真菌的啟動(dòng)子具有種屬的特異性,一些實(shí)驗(yàn)證明異源啟動(dòng)子具有較低的驅(qū)動(dòng)活性。為了獲得一種高效、穩(wěn)定的啟動(dòng)子應(yīng)用于將來的北冬蟲夏草的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn),本研究利用TAIL-PCR技術(shù),成功克隆了北冬蟲夏草GPD基因全長(Cmgpd)。RT-PCR分析表明北冬蟲夏草GPD基因是表達(dá)的,同時(shí)驗(yàn)證了其推測的僅有內(nèi)含子在轉(zhuǎn)錄中已被去除。通過生物信息學(xué)分析