抗H1亞型豬流感病毒單克隆抗體的制備及重鏈可變區(qū)基因的克隆.pdf

1、用RT-PCR方法從病毒中獲得HA基因，構建真核表達質粒HA-pCI-neo。以真核表達質粒HA-pCI-neo肌肉免疫6-8w雌性BALB/c小鼠，末次加強免疫后取小鼠脾細胞與骨髓瘤細胞Sp2/0-Ag-14進行融合。通過HA和HI試驗、間接ELISA試驗反復篩選陽性克隆，進行3次以上亞克隆，共獲得7株抗SIV H1N1亞型HA McAbs。把他們分別命名為8C4、8C6、9D6、8A4、8B1、9B2、11B4。運用分子生物學技術，

2、從雜交瘤細胞株8C4中提取總RNA，經反轉錄、PCR分別分離了重鏈可變區(qū)(VH)基因，并進行了序列分析。
　　 獲得7株抗SIV HA蛋白的單克隆抗體，其中8C4、8C6、9D6株具有血凝活性和中和活性。7株單抗腹水HI效價在512-256000之間，ELISA效價在16000-1024000。免疫球蛋白亞型試劑盒鑒定結果表明：8C4、8C6、9D6屬于Ig2a亞型；8A4屬于IgG1亞型；8B1屬于IgG2b亞型。Wester

3、n-blot分析結果顯示：7株單抗能與SIV H1亞型的HA蛋白在72KD處反應。血凝試驗表明8C4、8C6、9D6 3株單抗只與SIV H1N1和A/PR/8/34(H1N1)反應，而不與其他亞型的SIV、AIV、新城疫病毒（NDV）、鵝腺病毒等發(fā)生反應，表明這些McAbs能特異性識別SIV H1N1 HA蛋白而不與其他病毒反應。MDCK細胞中和試驗表明：8C4、8C6、9D63株抗SIV H1亞型HA McAbs顯示出較好的中和特性

4、，也進一步說明了他們具有一定的中和能力和潛在的治療功能。同樣是具有HI活性的單抗卻表現(xiàn)出不同的中和能力，這說明這些單抗之間存在著不同的抗原作用位點，這也為抗體的結構和功能性研究提供了條件。
　　 通過RT-PCR從單抗8C4中得到了VH基因。用BLAST和IMGT/V-QUEST數(shù)據(jù)庫比對可知，8C4-VH1基因由375個核苷酸組成，編碼125個氨基酸。包含4個FR區(qū)和CDR1、CDR2、CDR3三個高變區(qū)，CDR1含GYTFT

5、SYY 8個氨基酸、CDR2含IYPGDGST 8個氨基酸、CDR3含ARVMIAMDY 9個氨基酸。第22位和96位半胱氨酸，形成鏈內特征性二硫鍵。重鏈可變區(qū)由VH、DH和JH3個基因片段編碼，DH基因編碼重鏈V區(qū)大部分CDR3，JH基因片段連接V和C基因，編碼包括重鏈V區(qū)CDR3除DH編碼的其余部分和第4骨架區(qū)。由于可變區(qū)由幾個基因片段編碼，每個基因片段以基因群的方式存在，因此只有通過基因重排使各基因片段連接起來才能形成有功能的完整

6、的可變區(qū)基因。獲得的8C4的重鏈基因，V基因源于IgHV1S56*01，J基因源于IgHJ4*01，D基因可能有如下來源IgHD6-1*01或IgHD6-1*02或IGHD6-2*01或IgHD6-2*02或IgHD6-3*01，V、D、J3個基因經重排后相互連接在一起，形成V-D-J復合體，完成重鏈重排。該序列符合鼠Ig重鏈基本框架結構，框架區(qū)內無終止密碼子，是重排產生的序列。8C4-VH1同報告的序列號為IGHV1S56*01的同源