化學發(fā)光免疫分析技術概要

1、化學發(fā)光免疫分析技術,姓名：龐瀟卿專業(yè)：生化與分子生物學,目錄,,發(fā)光及化學發(fā)光的原理與分類,,化學發(fā)光劑及其作用原理,,化學發(fā)光免疫分析的原理與操作,,應用與發(fā)展前景,,發(fā)光：是指分子或原子中的電子吸收能量后，由基態(tài)（較低能級）躍遷到激發(fā)態(tài)（較高能級），然后再返回到基態(tài)，并釋放光子的過程。,,,,基態(tài)v0,激發(fā)態(tài)v,,能量,,,h.v,普朗克公式，能量?=h.vh為普朗克常數，v為頻率,發(fā)光,,發(fā)光的分類,光照發(fā)光,是指發(fā)光劑（熒

2、光素）經短波長的入射光照射后，電子吸收能量躍遷到激發(fā)態(tài)，在其回復至基態(tài)時，發(fā)射出較長波長的可見光（熒光）。,生物發(fā)光,是指發(fā)生在生物體內的發(fā)光現象。如螢火蟲的發(fā)光，反應底物為螢火蟲熒光素，在熒光素酶的催化下，利用ATP能，生成激發(fā)態(tài)氧化型熒光素，它在回復基態(tài)時多余的能量以光子的形式釋放出來。,化學發(fā)光,是指伴隨化學反應過程所產生的光的發(fā)射現象。某些物質（發(fā)光劑）在化學反應時吸收了反應過程中的化學能，使反應的產物分子或中間態(tài)分子中的電子躍

3、遷到激發(fā)態(tài)，當電子從激發(fā)態(tài)回復到基態(tài)時，以發(fā)射光子的形式釋放出能量的現象。,,根據形成激發(fā)態(tài)分子的能量來源不同可分為:,,間接化學發(fā)光,直接化學發(fā)光,,化學發(fā)光,A + B C* C* C + h.v,A + B C* C* + D C + D* D* D + h.v,化

4、學發(fā)光的原理,,,,,,,,,,,化學發(fā)光的分類,酶促化學發(fā)光： 辣根過氧化物酶-魯米諾（HRP-Luminol）系統(tǒng) 堿性磷酸酶（ALP）系統(tǒng) 黃嘌呤氧化酶系統(tǒng)非酶促化學發(fā)光： 吖啶酯系統(tǒng) 草酸酯系統(tǒng),閃光（Flash）：,發(fā)光時間在數秒內，如吖啶酯,輝光（Glow）：,發(fā)光時間在數十分鐘以上，如： HRP-Luminol系統(tǒng) 二氧雜環(huán)乙烷AP發(fā)光（AP-AMPPD）

5、系統(tǒng) 黃嘌呤氧化酶系統(tǒng),按化學反應類型,按發(fā)光持續(xù)時間,,,,,在化學發(fā)光反應中參與能量轉移并最終以發(fā)射光子的形式釋放能量的化合物，稱為化學發(fā)光劑或發(fā)光底物。可分為直接化學發(fā)光劑和酶促反應發(fā)光劑。,,化學發(fā)光劑,能作為化學發(fā)光劑的條件：①發(fā)光的量子產率高；②它的物理-化學特性要與被標記或測定的 物質相匹配；③能與抗原或抗體形成穩(wěn)定的偶聯結合物； ④其化學發(fā)光常是氧化反應的結果；⑤在所使用的濃度范圍內對生物體沒有毒性。

6、,直接化學發(fā)光劑在發(fā)光免疫分析過程中不需要酶的催化作用，直接參與發(fā)光反應，它們在化學結構上有產生發(fā)光的特有基團，可直接標記抗原或抗體。,,（一）直接化學發(fā)光劑,,1. 吖啶酯 2. 三聯吡啶釕,吖啶酯 在堿性條件下被H2O2氧化時，發(fā)出波長為470 nm的光，具有很高的發(fā)光效率，其激發(fā)態(tài)產物 N-甲基吖啶酮是該發(fā)光反應體系的發(fā)光體。,,,,,利用標記酶的催化作用，使發(fā)光劑（底物）發(fā)光，這一類需酶催化后發(fā)光的發(fā)光劑稱為酶促反應發(fā)光

7、劑。,（二） 酶促反應發(fā)光劑：,1. 魯米諾 2. AMPPD,魯米諾（Luminol）發(fā)光原理,,,辣根過氧化酶,文字內容,魯米諾（Luminol）增強發(fā)光反應原理,,雙負離子,,鐵氰化鉀催化H2O2產生O2,,3-氨基-鄰苯二甲酸（激發(fā)態(tài)）,,過氧化物不穩(wěn)定，分解產生N2,化學發(fā)光免疫分析(Chemiluminescence immunoass- ay,CLIA)，是將具有高靈敏度的化學發(fā)光測定技術與高特異性的免疫反應相結

8、合，用于各種抗原、半抗原、抗體、激素、酶、脂肪酸、維生素和藥物等的檢測分析技術。是繼放射免疫分析、酶免疫分析、熒光免疫分析和膠體時間分辨熒光免疫分析之后發(fā)展起來的一項新的免疫分析技術。,化學發(fā)光免疫分析,一、直接化學發(fā)光免疫分析,用吖啶酯直接標記抗體（抗原），與待測標本中相應的抗原（抗體）發(fā)生免疫反應后，形成固相包被抗體-待測抗原-吖啶酯標記抗體復合物，這時只需加入氧化劑（H2O2）和NaOH使成堿性環(huán)境，吖啶酯在不需要催化劑的情況下分

9、解、發(fā)光 。 由集光器和光電倍增管接收、記錄單位時間內所產生的光子能，這部分光的積分與待測抗原的量成正比，可從標準曲線上計算出待測抗原的含量。,直接化學發(fā)光的機理,--- 夾心法,,,,磁微粒模式圖,,,,,,,Y,,Y,,Y,Y,,Y,Y,,Y,Y,Y,Y,Y,,,,,Y,,特點抗原和抗體結合與未結合部分的易分離,磁微粒技術,,磁性納米粒子與無機或有機分子結合形成的可均勻分散于一定基液中具有高度穩(wěn)定性的膠態(tài)復合材料,二、化學

10、發(fā)光酶免疫分析,化學發(fā)光酶免疫分析（Chemiluminescence enzyme immunoassay，CLEIA）是用參與催化某一化學發(fā)光反應的酶如辣根過氧化物酶（HRP）或堿性磷酸酶（ALP）來標記抗原或抗體，在與待測標本中相應的抗原（抗體）發(fā)生免疫反應后，形成固相包被抗體-待測抗原-酶標記抗體復合物，經洗滌后，加入底物（發(fā)光劑），酶催化和分解底物發(fā)光，由光量子閱讀系統(tǒng)接收，光電倍增管將光信號轉變?yōu)殡娦盘柌⒓右苑糯?，再把它?/p>

11、傳送至計算機數據處理系統(tǒng)，計算出測定物的濃度。,此處添加內容,該分析系統(tǒng)采用辣根過氧化物酶（HRP）標記抗體（或抗原），在與反應體系中的待測標本和固相載體發(fā)生免疫反應后，形成固相包被抗體-待測抗原-酶（HRP）標記抗體復合物，這時加入魯米諾發(fā)光劑、H2O2和化學發(fā)光增強劑使產生化學發(fā)光。,,辣根過氧化物酶標記的化學發(fā)光免疫分析,辣根過氧化物酶標記化學發(fā)光免疫分析示意圖,,,待測樣品,標記抗體或抗原（磁顆粒）,,,,在磁場中洗滌去除未結合

12、的反應物,,,,,,,,,發(fā)光底物,,儀器檢測,包被抗體或抗原的反應管,,反應30-60分鐘,反應0-5分鐘,,,,,,,基本操作步驟,化學發(fā)光免疫分析儀,,優(yōu)點,1.靈敏度高 ：CLIA關鍵的優(yōu)越性，其靈敏度可達10-16mol/L(RIA為10-12mol/L) 。2.寬的線性動力學范圍 ：發(fā)光強度在4～6個量級之間與測定物質濃度間呈線性關系。 3.光信號持續(xù)時間長 ：輝光型的CLIA產生的光信號持續(xù)時間可達數小時甚至一天，簡化

13、了實驗操作及測量。 4.分析方法簡便快速 ：絕大多數分析測定均為僅需加入一種試劑（或復合試劑）的一步模式。 5.結果穩(wěn)定、誤差小：樣品系直接自己發(fā)光，不需要任何光源照射，分析結果靈敏穩(wěn)定可靠6.安全性好及使用期長 ：免除了使用放射性物質。,,,,,,,,,,,,單光子計數器,,,,,,,,光電倍增管,,,,,,,,,,,,高壓,,高速放大器,高速比較器,高速分頻器,發(fā)光樣品產生光子,,,激發(fā)光陰極產生光電子,,,在陽極上形成較

14、強信號,脈沖信號,相對發(fā)光單位數字脈沖(RLU),,,,,,,,在各打拿極之間得到能量和數目的倍增,化學發(fā)光免疫分析儀核心部件,化學發(fā)光免疫分析的應用（一）,①肺結核病常以人體血清中CA125 含量為疾病標記物，Wang 等建立了CA125 的毛細管化學發(fā)光免疫分析方法，以實現對肺結核病的檢測。 ②Knight 等采用化學發(fā)光免疫夾心分析方法對梅毒病毒進行檢測，并與傳統(tǒng)的分析方法快速血漿素反應（RPR）和酶免疫分析方法（ELI S

15、A）進行比較，通過對多種樣品進行檢測，并與RPR 及ELISA分析方法結果相比有 99.1％的正確率。 ③甲胎蛋白（AFP）為腫瘤疾病標志物，Zhang 等利用磁性微粒子和包被小管建立了AFP 的化學發(fā)光酶免疫分析方法。在該方法中，AFP抗體首先包被于兩種不同的固相載體上，如磁性微粒子和包被小管，再分別對這兩種包被模式建立的化學發(fā)光免疫分析方法進行比較。通過再抗體包被濃度、標記于抗體上HRP 的稀釋比例、分析所需時間、化學發(fā)光動力學等

16、角度進行衡量，顯示磁性微粒子具有較大的優(yōu)勢。,,醫(yī)學檢測,化學發(fā)光免疫分析的應用（二）,①Quan 等建立了食品中伏馬菌素B1 的化學發(fā)光酶免疫分析方法，與伏馬菌素B1 的 ELISA 方法相比，其方法靈敏度提高了10 倍。且通過樣品的添加回收率試驗表明其有良好的回收率，其分析結果與ELISA 分析方法與 HPLC 方法有良好的相關性。 ②Yang 等建立了食品中葡萄球菌腸毒素B（SEB）的碳納米管的化學發(fā)光免疫分析方法，通過將S

17、EB 抗體吸附在碳納米管表面 ，然后將抗體－碳納米管固定在聚碳酸酯表面，再通過增強化學發(fā)光免疫法測定SEB 含量。 ③Magliulo 等建立了牛奶中黃曲霉毒素M1的化學發(fā)光酶免疫分析方法，通過將黃曲霉毒素M牛血清白蛋白包被在聚丙烯板上，通過酶標二抗在含有魯米諾的基板上進行檢測。 ④Lin 等建立了農產品中黃曲霉毒素B1 的化學發(fā)光免疫分析方法。同時， 將建立的分析方法與黃曲霉毒素商品化酶聯免疫試劑盒進行了相關性試驗，相關系數

18、為0.9098，顯示其有較好的應用前景。,,食品安全檢測,化學發(fā)光免疫分析的應用（三）,①Christian 等通過化學發(fā)光酶免疫分析方法建立了環(huán)境內分泌干擾物炔雌醇的免疫分析方法，并通過建立的分析方法對表面水和污水處理廠的污水中的炔雌醇進行測定。 ②Pittman 等通過磁性小珠和生物素-親和素為載體建立了水樣和土樣中2，4，6-三硝基甲苯的免疫夾心電化學發(fā)光免疫分析方法。 ③Zhao 等通過建立微板式磁化學發(fā)光酶免疫分析方法

19、來對水樣中17 β-雌二醇進行檢測。通過微板磁性分離器可避免前處理過程以達到高通量分析，再結合高靈敏度的化學發(fā)光體系，建立了該方法。,,環(huán)境科學,發(fā)展與展望,化學發(fā)光免疫分析法具有選擇性好、靈敏度高、分析速度快、設備簡單等優(yōu)點，近年來在環(huán)境、臨床、食品、藥物檢測中得到了廣泛運用。實際檢測常常需要對大量、復雜、低豐度的樣品進行測定，因而化學發(fā)光免疫分析法逐漸向快速、高通量、高靈敏檢測的方向發(fā)展。 化學發(fā)光成像技術、化

20、學發(fā)光免疫分析與分離技術的聯用，可以使免疫分析的選擇性、靈敏度、檢測速度和檢測通量得到進一步提高。為了更好地適應臨床、環(huán)境等領域的實際應用，需要大力發(fā)展微型化、集成化和自動化的化學發(fā)光免疫分析儀器。隨著分子生物學及納米與傳感技術的進步，新的化學發(fā)光免疫分析原理與高靈敏的免疫分析方法將得到不斷發(fā)展，開發(fā)催化活性更高、穩(wěn)定性更好、發(fā)光動力學曲線更符合免疫分析的酶和底物并推廣到臨床檢測，發(fā)展新型標記技術用于信號放大，建立化學發(fā)光免疫分析新方法

21、，都將是未來的發(fā)展方向及研究重點。,發(fā)展與展望,目前化學發(fā)光免疫分析方法的發(fā)展趨勢主要表現在：（1）常見發(fā)光體系的不斷完善，隨著化學發(fā)光底物、氧化劑、催化劑、增敏劑及固相材料研究的不斷深入，性能更加優(yōu)異的化學發(fā)光體系將在今后研究中不斷涌現；（2）基因工程抗原、抗體的制備及廣泛應用，將進一步促進化學發(fā)光免疫分析方法的發(fā)展；（3）化學發(fā)光免疫分析方法與包括毛細管電泳等其他方法聯用，將提高化學發(fā)光免疫分析的速度以及靈敏度，拓寬化學發(fā)光體