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文檔簡介
1、實驗八 培養(yǎng)液及用液配制與消毒,1、培養(yǎng)液種類(medium)血清(FBS,F(xiàn)CS,CS,HS)合成培養(yǎng)基 如:Eagle MEM、 DMEM、PRMI 1640、Ham F12等無血清培養(yǎng)基(serum free medium),一、培養(yǎng)液及用液的種類,2、培養(yǎng)用液,1)水與平衡鹽溶液培養(yǎng)用水緩沖溶液生理鹽水平衡鹽溶液(BSS)如:PBS、 Hank’s、D-Hank’s液,2)其他培養(yǎng)用液消化液:胰蛋
2、白酶液、EDTA液抗生素:青鏈霉素pH調(diào)整液:HEPES液、NaHCO3谷氨酰氨液凍存液:用DMSO和培養(yǎng)液配制,二、細胞培養(yǎng)用液的要求及成分水:新鮮配置的三蒸水或去離子水平衡鹽溶液:無Ca2+、Mg2+的緩沖液 PBS:NaCl 8.0 g KCl 0.2 g
3、 Na2HPO4.H2O 1.56 g KH2PO4 0.20 加水至1000 ml,細胞生長條件,培養(yǎng)基:,培養(yǎng)基(培養(yǎng)液)是維持體外細胞生存和生長的溶液,分天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基。1)天然培養(yǎng)基:天然培養(yǎng)基有血清、血漿、和組織提取液(如雞胚和牛胚浸液)。優(yōu)點:營養(yǎng)成分豐富
4、,培養(yǎng)效果好缺點:來源受限。成分復(fù)雜,影響對某些實驗產(chǎn)物的提取和實驗結(jié)果的分析。易發(fā)生支原體污染,細胞生長條件,2)合成培養(yǎng)基:,,合成培養(yǎng)基是根據(jù)細胞生存所需物質(zhì)的種類和數(shù)量,用人工方法模擬合成的。目前已設(shè)計出許多種培養(yǎng)基,如TC199、MEM、RPMI-1640、 DMEM等?! ?yōu)點:標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn),組分和含量相對固定。成本低 。 缺點: 缺少某些成分,不能完全滿足體外細
5、胞生長需要。,細胞生長條件,人工合成培養(yǎng)基只能維持細胞生存,要想使細胞生長和繁殖,還需補充一定量的天然培養(yǎng)基(如血清)?! ⊙逯泻校骸 、俣喾N蛋白質(zhì)(白蛋白、球蛋白、鐵蛋白等) ; ②多種金屬離子; ?、奂に兀弧 、艽儋N附物質(zhì),如纖粘蛋白、冷析球蛋白、膠原等; ?、莞鞣N生長因子; ?、揶D(zhuǎn)移蛋白; ?、卟幻鞒煞?。,細胞生長條件,一般說來,含5%小牛血清的培養(yǎng)基對大多數(shù)細胞可以維持細胞
6、不死,但支持細胞生長一般需加10%血清.血清質(zhì)量好壞是實驗成敗的關(guān)鍵。常用血清有胎牛血潔、新生牛血清、小牛血情、兔血清、馬血清等,其中以胎牛血清質(zhì)量最好。優(yōu)質(zhì)血清的標(biāo)準(zhǔn):透明,淡黃色,無沉淀物,無細菌、支原體、病毒污染。血清的滅活(消除補體活性):56 ℃ ,30 分鐘。血清的消毒:過濾除菌。,細胞生長條件,消化液:胰蛋白酶作用于與賴氨酸或精氨酸相連接的肽健,除去細胞間粘蛋白及糖蛋白,影響細胞骨架,從而使細胞分離。
7、 胰蛋白酶是一種黃白色粉末,用無Ca2+、Mg2+的PBS緩沖液配制常用的胰蛋白酶液濃度是0.25% 。用濾器過濾除菌。胰蛋白酶液消化時間:2-10分鐘。用含血清培養(yǎng)液終止其對細胞的消化作用。,細胞生長條件,抗菌素的使用:在培養(yǎng)液配制后,培養(yǎng)液內(nèi)常加適量抗菌素,以抑制可能存在的細菌的生長。通常是青霉素和鏈霉素聯(lián)合使用。培養(yǎng)基內(nèi)青霉素、鏈霉素最終使用濃度為每毫升100單位。慶大霉素:每毫升100單位——方便、廣
8、譜、穩(wěn)定。,細胞生長條件,基礎(chǔ)培養(yǎng)基 80%一95%血清 5%一20%碳酸氫鈉 2.0 g/L青、鏈霉素 各100單位/毫升,完全培養(yǎng)基的組成,細胞生長條件,RPMI-1640培養(yǎng)粉 1袋 碳酸氫鈉 2.0 g 青、鏈霉素 各100單位/毫升 加三蒸水 至1
9、000ml 過濾除菌,調(diào)節(jié)pH值至7.2 加血清(終濃度 10%)。,三、培養(yǎng)基的配制,細胞生長條件,1、濾器準(zhǔn)備,清洗好過濾器,干燥,放入一張孔徑0.22μm的微孔濾膜,用布包裝好,15磅20 min進行高壓滅菌處理。 在超凈臺內(nèi)打開過濾器架好,膠管一端接入濾泵再插入待除菌的液體中,出口端膠管深入到已消毒好的瓶子中。 過濾后要檢查濾膜是否完好無損。,2、配制步驟,1.準(zhǔn)備超純水或三蒸水。2.加入合成培養(yǎng)基
10、干粉,用磁力攪拌一定時間(2—4 h)使之充分溶解。 3.配制RPMll640培養(yǎng)基時應(yīng)通入適量C02或加入6 mol/L鹽酸調(diào)pH至6.0左右,這樣才能充分溶解。,,4.加入一定量NaHCO,調(diào)節(jié)pH至7.0左右。 5.加水至最終體積。6.在超凈臺中對溶液進行濾過除菌,分裝入250 mL或500 mL玻璃瓶中,用翻帽塞塞緊瓶口。 7.瓶口封好,4℃冰箱貯存。,四 注意事項,1.過濾時壓力不要太大,以壓力數(shù)字2為宜,否則細菌
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