生物電子顯微技術(shù)

1、生物電子顯微技術(shù)---透射電鏡結(jié)構(gòu)與原理,濱州醫(yī)學(xué)院電鏡室劉文波辦公室：實(shí)驗(yàn)B樓B103室聯(lián)系電話(huà)：0535-6913074,電子顯微學(xué)的發(fā)展史,人眼：人眼的分辨能力約為0.1~0.2mm。光學(xué)顯微鏡：光學(xué)顯微鏡分辨率約為0.2um。 電子顯微鏡：電鏡產(chǎn)生的理論基礎(chǔ)1.1897年，Thomson發(fā)現(xiàn)了電子，并證明它是一種帶負(fù)電荷的粒子。2.1924年，法國(guó)數(shù)理學(xué)家de Broglie提出了微觀(guān)粒子的波粒二重性原理，并

2、 推導(dǎo)出電子的波長(zhǎng)與加速電壓之間的關(guān)系為： λe≈ (nm) 可見(jiàn)：加速電壓越高，對(duì)應(yīng)電子束的波長(zhǎng)越短。 計(jì)算表明電子波長(zhǎng)比可見(jiàn)光波長(zhǎng)短的多,如加速電壓為80KV時(shí)，電子的波長(zhǎng)約為0.00418 nm ，相當(dāng)于可見(jiàn)光中綠光波長(zhǎng)的十萬(wàn)分之一。3.1926年，德國(guó)應(yīng)用物理學(xué)家H.Busch提出了幾何電子光學(xué)理論。他指出：加速電子在軸對(duì)稱(chēng)電場(chǎng)或磁場(chǎng)中的運(yùn)動(dòng)

3、規(guī)律完全服從幾何光學(xué)定律，進(jìn)而制造出了靜電透鏡和電磁透鏡。,,電子顯微學(xué)的發(fā)展史,電子顯微鏡的發(fā)明 1931~1933年，德國(guó)M.Knoll和E.Ruska發(fā)明了第一臺(tái)電子顯微鏡。（結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，只有兩級(jí)放大透鏡和16×） 1938年，德國(guó)，E.Ruska，第1臺(tái)真正的透射電鏡，放大倍數(shù)：1200倍 （與當(dāng)時(shí)最好的光學(xué)顯微鏡的放大倍數(shù)相當(dāng)）  1939 年

4、，德國(guó) Siemens 公司生產(chǎn)了第一臺(tái)商品透射電鏡，其分辨率為 10nm 左右 。 目前，最新透射電鏡分辨率達(dá)到0.07nm，放大倍數(shù)達(dá)到150萬(wàn)倍。 （Ruska：被稱(chēng)為電鏡之父，并獲得1986年諾貝爾物理學(xué)獎(jiǎng)，電鏡的發(fā)明被認(rèn)為是20世紀(jì)最重要的科學(xué)發(fā)明之一）,,December 10, 1986Nobel Prize in Physics (City-Hall of Stockholm),,htt

5、p://ernst.ruska.de/daten_e/mainframe_e.html,1986年諾貝爾物理學(xué)獎(jiǎng)獲得者,Ernst Ruska Gerd Binnig Heinrich Rohrer 發(fā)明電子顯微鏡（1931年） 發(fā)明掃描隧道顯微鏡（1982年）,第一臺(tái)透射電子顯微鏡光路圖及其與光學(xué)顯微

6、鏡的比較,這是Ruska在1931-1933年完成的。從這時(shí)起，電子顯微鏡的基本光學(xué)原理始終沒(méi)有改變過(guò)。后來(lái)的改進(jìn)主要是提高分辨本領(lǐng)和使用性能等。,電子顯微鏡的分類(lèi),一、電子散射(electron scattering)現(xiàn)象電子散射是高能入射電子與固體樣品相互作用所產(chǎn)生的一種物理現(xiàn)象。1.直接透射電子：特點(diǎn)：電子運(yùn)動(dòng)方向不變，速度（能量）不變。2.彈性散射電子：特點(diǎn)：電子運(yùn)動(dòng)方向改變，但速度（或能量）保持不變。3.非彈性散射

7、電子(inelastic electron)：特點(diǎn)：電子運(yùn)動(dòng)方向改變，速度（或能量）也發(fā)生改變。,電子顯微鏡的分類(lèi),二、電子與樣品的作用方式1.泛光式：電子束以一定的尺寸照射在樣品上，使用中電子束固定，樣品的一定范圍被同時(shí)照射并同時(shí)被觀(guān)察記錄。2.掃描式：電子束以極細(xì)的點(diǎn)在樣品表面按照一定的方向和速度移動(dòng)，如同電視成像一樣。樣品上待觀(guān)察區(qū)域被電子束逐點(diǎn)逐行照射，其結(jié)構(gòu)也被逐點(diǎn)逐行的成像。,,入射電子與樣品的兩種作用方式,電子顯微鏡

8、的分類(lèi),三、電子顯微鏡的分類(lèi)依據(jù)：按所采用的信號(hào)及電子束與樣品的作用方式。1.透射電子顯微鏡(TEM)：利用泛光式電子束及透射電子（包括直接透射電子，彈性散射電子和非彈性散射電子）成像。2.掃描電子顯微鏡(SEM)：利用掃描式電子束及二次電子（包括背散射電子）成像。用于觀(guān)察樣品表面的形貌結(jié)構(gòu)。3.掃描透射電子顯微鏡(STEM)：既透射電鏡的功能又具有掃描電鏡的功能，通常是在透射電鏡的基礎(chǔ)上加裝掃描附件。4.電子探針(EMP)：

9、利用掃描式電子束及特征X-射線(xiàn)成像。用于樣品表層微區(qū)化學(xué)成分定性或定量分析。5.分析電子顯微鏡(AEM)：透射電鏡或掃描電鏡配能譜儀或波譜儀。6.俄歇電子譜儀(Auger ES)：利用掃描式電子束及俄歇電子成像。其中，透射電鏡和掃描電鏡在生物學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用最為廣泛。,電子顯微鏡的分類(lèi),四、透射電鏡的分類(lèi)按最高加速電壓分類(lèi)：1.普通透射電鏡：加速電壓≤120KV，主要應(yīng)用于生物學(xué)等領(lǐng)域。2.高壓透射電鏡：200KV≤加速電壓≤5

10、00KV，數(shù)量多，在材料領(lǐng)域應(yīng)用最廣泛。3.超高壓透射電鏡：加速電壓≥1000KV，體積龐大、價(jià)格昂貴、數(shù)量少。,FEI Morgagni ( 100KV) FEI Tecnai? Twin 12 (120KV),JEOL JEM-1011 (100KV) JEOL JEM-1400 (120KV),HITACHI H-7650(120KV),FE

11、I Tecnai F20 (200KV) HITACHI H-9500(300KV),HITACHI H-1500(1300KV),JEOL 3000KV超高壓電鏡,FEI Qunta200 掃描電子顯微鏡,JEM-1200 EX 透射電鏡（帶掃描附件）,JAX-8100電子探針儀,JEM-1400型透射電子顯微鏡,透射電子顯微鏡工作原理,透射電子顯微鏡是以波長(zhǎng)極短的電子束做照明源，以電磁透鏡聚焦成

12、像的一種高分辨本領(lǐng)、高放大倍數(shù)的電子光學(xué)儀器。對(duì)燈絲加上一定的工作電壓使其發(fā)射電子束，經(jīng)柵極的會(huì)聚作用和陽(yáng)極的加速作用，以一定直徑的束斑照射下來(lái)，經(jīng)過(guò)聚光鏡的進(jìn)一步會(huì)聚作用照射在下面的樣品上。透過(guò)樣品的電子束將帶有樣品結(jié)構(gòu)，經(jīng)過(guò)物鏡、中間鏡和投影鏡的多級(jí)放大作用，最后照射在熒光屏上，激發(fā)熒光素發(fā)光，從而在熒光屏上呈現(xiàn)出放大的樣品圖像。在熒光屏下方是照相室，可以將樣品的放大圖像曝光在底片上，經(jīng)過(guò)顯影、定影后將圖像保存下來(lái)。,電子光學(xué)系統(tǒng)

13、,電子光學(xué)系統(tǒng)即電鏡的鏡體。由于機(jī)械剛度的要求，鏡體一般是直立的，即：上端是照明系統(tǒng)，中部是成像系統(tǒng)，下端是像的觀(guān)察和記錄系統(tǒng)，由觀(guān)察室和照像室組成。 優(yōu)點(diǎn)：①直立的垂直鏡筒要求最小的支撐。②由于透鏡本身重量向下壓在透鏡之間的真空密封圈上，有助于保持真空不漏氣。電鏡的鏡筒自上而下可以分成三個(gè)主要部分：1.照明系統(tǒng)：由電子槍加上一個(gè)或幾個(gè)聚光鏡組成。2.成像系統(tǒng)和換樣品機(jī)構(gòu)：包括：樣品室（可以加入樣品并按要求使樣品在X、Y軸平移

14、，高檔樣品臺(tái)還能控制樣品在垂直Z軸方向的移動(dòng)以及在TX、TY兩個(gè)方向的旋轉(zhuǎn)。 成像系統(tǒng)：由物鏡、中間鏡和投影鏡等組成。3.圖像觀(guān)察和記錄系統(tǒng)：包括熒光屏、底片照相室、CCD等圖像觀(guān)察和記錄裝置。,,,,照明系統(tǒng),一、電子槍 電子槍是電鏡的照明源，能產(chǎn)生亮度極高的細(xì)電子束。電子槍由燈絲陰極、柵極（或稱(chēng)韋氏圓筒）和加速陽(yáng)極組成。燈絲是用直徑0.1mm的鎢絲做成V字形，通電加熱至2500-2800K時(shí)，在尖端即產(chǎn)生

15、熱電子發(fā)射，形成照明束。在燈絲下方為陽(yáng)極，起加速電子的作用。柵極用于控制電子束形狀和發(fā)射強(qiáng)度。現(xiàn)代電鏡一般采用自給柵偏壓電子槍?zhuān)鋬?yōu)點(diǎn)是柵偏壓電阻起負(fù)反饋?zhàn)饔?，從而能穩(wěn)定電子束流的作用。由于柵極的排斥作用，使電子會(huì)聚成束。其中束交叉點(diǎn)處束徑約50um，電子密度最高，是電鏡的實(shí)際電子源。,,自給柵偏壓電子槍工作示意圖,照明系統(tǒng),若燈絲處于飽和狀態(tài)時(shí)，逐漸減少加熱電流使之比飽和點(diǎn)稍小一點(diǎn)，此時(shí)屏上出現(xiàn)如下圖的圖像。此稱(chēng)燈絲像，中心亮斑是

16、燈絲尖的像，周?chē)?quot;暈輪"是柵極帽的像，此燈絲像在電鏡調(diào)整中很有用,如燈絲像是對(duì)稱(chēng)的話(huà)則燈絲是對(duì)中的，否則燈絲是不對(duì)中的。,照明系統(tǒng),二、聚光鏡聚光鏡的作用是把來(lái)自電子槍的電子束進(jìn)一步匯聚，并照射到樣品上。雙聚光鏡系統(tǒng)：C1是一個(gè)強(qiáng)透鏡，它的作用是把有效光源的尺寸縮小，最小可達(dá)1-2um。第二聚光鏡(C2)是一個(gè)弱透鏡，是為了使照明孔徑角足夠小和在聚光鏡與物鏡之間提供一個(gè)較大的樣品空間，以便能夠放進(jìn)樣品臺(tái)以及其它

17、的附件。第二聚光鏡用以控制照明亮度、照明孔徑角和照明斑的尺寸，在第二聚光鏡之下裝有第二聚光鏡活動(dòng)光闌(100，200，300，400um的圓孔)，根據(jù)需要可選取不同的光闌孔。,從樣品平面看，當(dāng)C1焦距確定后，C2處于正聚集狀態(tài)時(shí)，照射樣品面積最小、最亮；散焦時(shí)，亮度降低，照射面積增大。所以，調(diào)節(jié)C2工作電流改變聚集狀態(tài)，可以方便地連續(xù)控制樣品上的被照射面積和亮度，進(jìn)而改變熒光屏上光斑大小和亮度。 在電鏡的實(shí)際操作中，就是通過(guò)改變C

18、2的電流來(lái)改變光斑大小和亮度的。,成像系統(tǒng),成像系統(tǒng)包括樣品室、物鏡、中間鏡和投影鏡等樣品室 樣品室位于第二聚光鏡下面。樣品載于銅網(wǎng)上，銅網(wǎng)放在樣品架(或稱(chēng)樣品桿)上，插入樣品室。,利用樣品移動(dòng)旋桿來(lái)移動(dòng)樣品的水平位置（X-Y方向）,日立H-600型 透射電鏡,電機(jī)控制樣品移動(dòng)示意圖,成像系統(tǒng),物鏡 物鏡位于在樣品室下面。其作用是形成樣品的第一級(jí)放大像和通過(guò)調(diào)節(jié)物鏡線(xiàn)圈的激勵(lì)電流，相應(yīng)地改

19、變物鏡的焦距從而對(duì)像進(jìn)行聚焦。 物鏡是電鏡的最關(guān)鍵部分，由它對(duì)樣品做第一級(jí)放大，物鏡中任何缺陷都將被成象系統(tǒng)其它透鏡進(jìn)一步放大。因此，電鏡的分辨本領(lǐng)主要取決于物鏡的分辨本領(lǐng)， 物鏡中裝有一活動(dòng)光欄，是由非磁性金屬如鉑或鉬制成，一般有3~ 4個(gè)大小不同的孔供選擇。物鏡光欄能提高成像的反差。輕微改變物鏡電流能起到聚焦圖像的作用。中間鏡 中間鏡的作用是把物鏡形成的一次放大像或衍射花樣經(jīng)多級(jí)放大后投射到投射鏡的

20、物平面上。投影鏡 投影鏡的作用是把中間鏡形成的放大像再經(jīng)過(guò)放大并投射到熒光屏上，從而形成終象。 電鏡的總放大率為所有成像透鏡放大率之積， 即：Mall = Mo × Mi1 × Mi2 × MP 電鏡總放大倍率變化的實(shí)現(xiàn)方法：1.控制某級(jí)或幾級(jí)透鏡的是否工作來(lái)實(shí)現(xiàn)。2.利用中間鏡倍率的變化來(lái)實(shí)現(xiàn)。,圖像觀(guān)察與記錄系

21、統(tǒng),觀(guān)察室 在投射鏡下面是像的觀(guān)察和記錄系統(tǒng)，終像將顯示在熒光屏上。大熒光屏（直徑160mm）于觀(guān)察，小熒光屏（直徑20mm）用于拍照聚焦。,照相室 在大熒光屏的下面是照相暗盒，用于把終像拍攝記錄在底片上。而且由于照相底片的分辨本領(lǐng)大大高于熒光屏，因此，拍攝出來(lái)的底片往往含有在熒光屏上直接觀(guān)察時(shí)看不到的細(xì)節(jié)。 多數(shù)新購(gòu)電鏡都加配了CCD數(shù)字成像系統(tǒng)。,冷卻水系統(tǒng),作用：為電鏡的正常工作提供相對(duì)恒定的溫度環(huán)

22、境，提高儀器工作的穩(wěn)定性。組成：冷卻水機(jī)、冷卻水通道、水壓檢測(cè)保護(hù)裝置等。由于要給抽真空的油擴(kuò)散泵冷卻，所以必須保證在關(guān)閉電鏡后，冷卻水至少再繼續(xù)工作十分鐘才能關(guān)閉，否則由于擴(kuò)散泵油得不到充分冷卻而污染鏡筒，降低儀器分辨率。,循環(huán)冷卻水系統(tǒng)示意圖,真空系統(tǒng),電鏡真空系統(tǒng)的組成：1.真空泵（包括機(jī)械泵和油擴(kuò)散泵，為抽真空設(shè)備）2.真空管道及自動(dòng)閥門(mén)系統(tǒng)（真空管道包括連接管道和鏡筒內(nèi)空間，真空閥門(mén)既有電磁閥門(mén)，又有氣壓閥門(mén)，這需要空

23、氣壓縮機(jī)為其提供一定壓力的空氣。）3.真空檢測(cè)裝置（包括皮喇尼真空規(guī)和潘寧規(guī)，用于檢測(cè)真空系統(tǒng)各部分的真空度）常用壓強(qiáng)單位： 標(biāo)準(zhǔn)大氣壓、毫米汞柱(mmHg)、托（乇）(Torr)、帕斯卡(Pa) 1標(biāo)準(zhǔn)大氣壓=760毫米汞柱=1.013×105帕斯卡 1托=1毫米汞柱≈133帕電

24、鏡鏡筒真空的獲得： 電鏡鏡簡(jiǎn)要求真空度一般約為10-3Pa。常采用兩級(jí)泵串聯(lián)：第一級(jí)是機(jī)械泵獲得10 Pa~1 Pa的低真空，作為第二級(jí)泵的預(yù)真空；第二級(jí)采用油擴(kuò)散泵使真空到達(dá)10-3Pa。對(duì)于要求真空度高于10-3Pa的電鏡，往往需要三級(jí)串聯(lián)系統(tǒng)，第三級(jí)通常采用吸附泵或擴(kuò)散泵。若采用渦輪分子泵、離子泵等則可以獲得更高的真空。,真空機(jī)械泵與空氣壓縮機(jī),,油擴(kuò)散泵外形,JEM-1400透射電鏡 真空系統(tǒng)工作界面,

25、抽高真空的必要性：高速運(yùn)動(dòng)的電子與氣體分子相互碰撞，使電子發(fā)生散射，引起“眩光”碰撞使氣體電離引起電子束的不穩(wěn)定或“閃爍”縮短燈絲壽命污染樣品真空系統(tǒng)的組成：真空泵（前級(jí)機(jī)械泵、油擴(kuò)散泵或離子泵）真空管道與控制閥門(mén)真空檢測(cè)系統(tǒng)（皮喇尼真空規(guī)和潘寧真空規(guī)）,JEM-1400透射電鏡鏡筒結(jié)構(gòu),透射電鏡的一般操作順序,開(kāi)機(jī)①接通電源，打開(kāi)冷卻水；②抽真空：預(yù)抽真空（一般不超過(guò)5min）→加熱油擴(kuò)散泵（一般需20～25min

26、）→抽高真空→約5min后儀器可進(jìn)入工作狀態(tài)；③設(shè)定高壓值并接通高壓；④接通各透鏡工作電源； ⑤加燈絲束流至所需值；此時(shí)，熒光屏上應(yīng)出現(xiàn)光斑。,透射電鏡的一般操作順序,加入要觀(guān)察的樣品根據(jù)需要改變放大倍數(shù)，利用第二聚光鏡改變光斑大小和亮度，利用物鏡聚焦圖像，在熒光屏上進(jìn)行圖像觀(guān)察，必要時(shí)可拍照保存。觀(guān)察結(jié)束后，應(yīng)依次關(guān)閉燈絲、透鏡電源和高壓，取出樣品，關(guān)閉電鏡主機(jī)電源。并做好使用記錄。約10分鐘后關(guān)閉冷卻水系統(tǒng)。,,,