血紅蛋白的提取和分離好

1、,,血紅蛋白含有四條肽鏈,每條肽鏈環(huán)繞一個亞鐵血紅素基團，此基團可攜帶一分子氧或一分子二氧化碳，血紅蛋白因含有血紅素而呈紅色。,課題3 血紅蛋白的提取和分離,專題5 DNA和蛋白質技術,一、基礎知識:,學生活動1:,1 、分離生物大分子的基本思路是什么？,2 、不同蛋白質的特性在哪些方面存在差異？,3 、本課題我們將利用血紅蛋白與雜質蛋白哪方面的差異進行提純？,4 、為什么不用雞的血紅細胞而用人的血紅細胞作為實驗材料？,5 、用

2、什么方法分離相對分子質量不同的蛋白質 ？,一、基礎知識--蛋白質提取和分離原理,蛋白質提取與分離的依據(jù)－－蛋白質的物理化學性質：,形狀、大小、電荷性質和多少、溶解度、吸附性質、親和力等千差萬別。,（1）原理：（2）材料,大分子通過多孔凝膠顆粒的間隙，路程短，流動快；小分子穿過多孔凝膠顆粒的內部，路程長，流動慢。,多孔性的多糖類化合物，如葡聚糖、瓊脂糖。,(一)凝膠色譜法,（3）分離過程,洗脫：從色譜柱上端不斷注入緩沖液，

3、 促使蛋白質分子的差速流動。,(一)凝膠色譜法,(一)凝膠色譜法,㈠ 凝膠色譜法（分配色譜法）：,1、什么是凝膠？,2、什么是凝膠色譜法？,學生活動2:,3、凝膠色譜法的原理是什么？,4、請用自己的話總結出凝膠色譜法分離相對分子質量不同蛋白質的具體過程。,1 、什么是緩沖液？,2、 緩沖液的作用是什么？,學生活動3:,3、 緩沖液是如何配制的？你所學過的人體血液的緩沖物質有哪些？,4、 本實驗加的是什么緩沖液？為何要加緩沖液？,（

4、二）、緩沖溶液,由弱酸和相應的強堿弱酸鹽組成。如H2CO3/NaHCO3，醋酸/醋酸鈉，NaH2PO4/Na2HPO4等,緩沖溶液－－洗脫劑組成：配制：作用：,調節(jié)緩沖劑的比例，可配制不同pH的緩沖液。,抵制外界酸堿對溶液pH的干擾而保持 pH穩(wěn)定。,（二）、緩沖溶液,1 、什么是電泳？,2、 影響電泳遷移速度的因素有哪些？,學生活動4:,4、電泳分離各種分子的原理是什么？,（三）、電泳,3、 如何消除電荷對電泳遷移速度的

5、影響？,5 、請描述電泳的過程？,2．凝膠電泳法：,（1）原理：,不同蛋白質的帶電性質、電量、形狀和大小不同，在電場中受到的作用力大小、方向、阻力不同，導致不同蛋白質在電場中的運動方向和運動速度不同。,影響蛋白質分子運動速度的因素,(三)電泳,1.電泳的概念,指帶電粒子在電場的作用下發(fā)生遷移的過程.,影響蛋白質分子運動速度的因素,√,√,√,√,√,√,√,在一定pH下，使蛋白質基團帶上正電或負電；加入帶負電荷多的SDS，形成“蛋

6、白質－SDS復合物”，使蛋白質遷移速率僅取決于分子大小。,（2）分離方法：（3）分離過程：,瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳等。,(三)電泳,電泳檢測結果,,,,二、實驗操作,蛋白質的提取和分離一般分為四步：（1）樣品處理：包括洗滌紅細胞；血紅蛋白釋放；離心分離等操作收集到的血紅蛋白溶液。（2）粗分離：透析除去分子較小的雜質。（3）純化：通過凝膠色譜法將分子量較大的雜質蛋白質除去。（4）純度鑒定：通過聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定

7、。,（一）樣品處理,1、紅細胞的洗滌：目的是去除雜蛋白。要加入檸檬酸鈉防止血液凝固；離心將血液分層，用膠頭吸管吸出黃色血漿；用生理鹽水洗滌。2、血紅蛋白的釋放：在蒸餾水和甲苯作用下，紅細胞破裂釋放3、分離血紅蛋白溶液：離心分層；濾紙過濾去除脂溶性沉淀層；分液漏斗分出紅色透明液體。4、透析：裝入透析袋并置于磷酸緩沖液中（PH為7.0）透析。,二、實驗操作,,血液組成成分,閱讀思考：血液由______和________兩部分組

8、成。血細胞中________細胞數(shù)量最多，紅細胞的含量最高的有機化合物是_____________。該化合物是由 _____________和____________構成的，其中每個亞基中都含有一個能與O2和CO2結合的___________基團。,課題3 血紅蛋白的提取與分離,返回,1.洗 滌 紅 細 胞,閱讀思考：洗滌的目的是什么？洗滌過程：,血液100mL,重復洗滌3次，直至上清液沒有黃色,課題3 血紅蛋白的提取與分離

9、,采集得到雞血,初次離心后的結果,3次洗滌后的結果,返回,2.釋放血紅蛋白,閱讀思考：釋放血紅蛋白過程中，在洗滌好的紅細胞加入了哪些物質？為了加速釋放過程，采取了什么措施？,①目的分析：②蒸餾水的作用是______________________________。③加入甲苯的作用是____________________________。④充分攪拌的目的是____________________________。,使紅細胞大量

10、吸水脹裂,溶解紅細胞的細胞膜,加速紅細胞的破裂,課題3 血紅蛋白的提取與分離,(2)血紅蛋白的釋放：,加蒸餾水到原血液體積，再加40％體積的甲苯 ，置于磁力攪拌器上充分攪拌10分鐘（加速細胞破裂）,細胞破裂釋放出血紅蛋白。,磁力攪拌器,返回,3.分離血紅蛋白,分離過程,紅細胞混合液,,,,,,,,,,,燒杯,課題3 血紅蛋白的提取與分離,(3)分離血紅蛋白溶液：,①過程：將攪拌好混合液轉移到離心管內，以2000r/min的速度離心

11、10 min。②試管中溶液層次：第1層（最上層）：甲苯層（無色透明）；第2層（中上層）：脂溶性物質沉淀層（白色薄層固體）；第3層（中下層）：血紅蛋白的水溶液層（紅色透明液體）；第4層（最下層）：雜質沉淀層（暗紅色）。③分離：用濾紙過濾，除去脂溶性沉淀層，于分液漏斗中靜置片刻后，分出下層的紅色透明液體。,甲苯層（無色透明）,白色薄層固體,紅色透明液體,雜質沉淀層（暗紅色）,試管中溶液層次,返回,課題3 血紅蛋白的提取與分離,4.透析血紅

12、蛋白,利用透析袋透析,透析過程,返回,課題3 血紅蛋白的提取與分離,純化－－凝膠色譜操作,1.凝膠色譜柱的制作：,2.凝膠色譜柱的裝填：,教材圖5－19,3.樣品的加入和洗脫,,,（二）凝膠色譜操作,（1）凝膠色譜柱的制作： ①取長40厘米，內徑1.6厘米的玻璃管，兩端需用砂紙磨平。②底塞的制作：打孔→挖出凹穴→安裝移液管頭部→覆蓋尼龍網(wǎng)，再用100目尼龍紗包好，插到玻璃管的一端。注意事項：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴

13、底面，否則難以鋪實尼龍網(wǎng)，還會導致液體殘留，蛋白質分離不徹底。③頂塞的制作：打孔→安裝玻璃管。④組裝：將上述三者按相應位置組裝成一個整體。⑤安裝其他附屬結構。,裝配好的凝膠柱,返回,材料：交聯(lián)葡聚糖凝膠G-75；20mmol/L磷酸緩沖液裝填:,課題3 血紅蛋白的提取與分離,2.凝膠色譜柱的裝填：,立刻用磷酸緩沖液洗滌平衡12h,洗滌平衡,一次性緩慢倒入；輕輕敲打,裝填懸浮液,凝膠顆粒＋洗脫液→沸水浴,凝膠顆粒＋蒸餾水→充分溶脹,根

14、據(jù)色譜柱體積計算凝膠用量,色譜柱垂直固定在支架上,配制懸浮液,計算稱量凝膠,固定色譜柱,（2）凝膠色譜柱的裝填,①凝膠的選擇：A、材料：交聯(lián)葡聚糖凝膠（G-75）。B、代表意義：“G”表示凝膠的交聯(lián)程度，膨脹程度及分離范圍。75表示凝膠的得水值，即每克凝膠膨脹時吸水7.5克。 ②凝膠的前處理：配制凝膠懸浮液：計算并稱取一定量的凝膠浸泡于蒸餾水或洗脫液中充分溶脹后，配成凝膠懸浮液。③凝膠色譜柱的裝填方法：A、固定：將色譜柱裝置固定在支

15、架上。B、裝填：將凝膠懸浮液一次性的裝填入色譜柱內，裝填時輕輕敲動色譜柱，使凝膠填裝均勻。注意：1、凝膠裝填時盡量緊密，以降低凝膠顆粒之間的空隙。 2、裝填凝膠柱時不得有氣泡存在：因為氣泡會攪亂洗脫液中蛋白質的洗脫次序，降低分離效果。,④洗滌平衡：裝填完畢后，立即用緩沖液洗脫瓶，在50cm高的操作壓下，用300ml的20mmol/l的磷酸緩沖液（pH為7.0）充分洗滌平衡12小時。注意：1、洗脫液面不要低于凝膠表面，否則可能有氣泡混入，

16、影響液體在柱內的流動與最終生物大分子物質的分離效果。2、不能發(fā)生洗脫液流干，露出凝膠顆粒的現(xiàn)象。,3.樣品加入與洗脫,①調節(jié)緩沖液面：打開下端出口，使柱內緩沖液緩慢下降到與凝膠面平齊，關閉出口。 ②滴加透析樣品：吸管吸1ml樣品加到色譜柱的頂端，滴加樣品時，吸管管口貼著管壁環(huán)繞移動加樣，同時注意不要破壞凝膠面。 ③樣品滲入凝膠床：加樣后打開下端出口，使樣品滲入凝膠床內，等樣品完全進入凝膠層后，關閉下端出口。 ④洗脫：小

17、心加入pH=7.0 的20mmol/l的磷酸緩沖液到適當高度，連接緩沖液洗脫瓶，打開下端出口進行洗脫。 ⑤收集：待紅色的蛋白質接近色譜柱底端時，用試管收集流出液，每5ml收集一試管，連續(xù)收集。（在分離過程中，如果紅色區(qū)帶均勻一致的移動，說明色譜柱制作成功） ⑥注意：正確的加樣操作：1、不要觸及并破壞凝膠面。2、貼壁加樣。3、使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動。,3.樣品的加入和洗脫,,,,3.樣品加入與洗脫,注意：正確的加樣操作是：1

18、、不要觸及并破壞凝膠面。2、貼壁加樣。3、使吸管管口沿管壁環(huán)繞移動。,收集得到的純化后的血紅蛋白,課題3 血紅蛋白的提取與分離,注意事項,1. 紅細胞的洗滌： 洗滌次數(shù)不能過少；低速、短時離心。2. 凝膠的預處理： 沸水浴法時間短，還能除去微生物和氣泡3. 色譜柱的裝填： 裝填盡量緊密，降低顆粒間隙；無氣泡；洗脫液不能斷流。4. 色譜柱成功標志：紅色區(qū)帶均勻一致地移動。,,觀察你處理的血液

19、樣品離心后是否分層（見教科書圖5-18），如果分層不明顯，可能是洗滌次數(shù)少、未能除去血漿蛋白的原因。此外，離心速度過高和時間過長，會使白細胞和淋巴細胞一同沉淀，也得不到純凈的紅細胞，影響后續(xù)血紅蛋白的提取純度。,三、實驗結果分析與評價,1、你是否完成了對血液樣品的處理？你能描述處理后的樣品發(fā)生了哪些變化嗎？,三、實驗結果分析與評價,2、你裝填的凝膠色譜柱是否有氣泡產(chǎn)生？你的色譜柱裝填得成功嗎？你是如何判斷的？,由于凝膠是一種半透明的介質

20、，因此可以在凝膠柱旁放一支與凝膠柱垂直的日光燈，檢查凝膠是否裝填得均勻。此外，還可以加入大分子的有色物質，例如藍色葡聚糖—2000或紅色葡聚糖，觀察色帶移動的情況。如果色帶均勻、狹窄、平整，說明凝膠色譜柱的性能良好。如果色譜柱出現(xiàn)紋路或是氣泡，輕輕敲打柱體以消除氣泡，消除不了時要重新裝柱。,如果凝膠色譜柱裝填得很成功、分離操作也正確的話，能清楚地看到血紅蛋白的紅色區(qū)帶均勻、狹窄、平整，隨著洗脫液緩慢流出；如果紅色區(qū)帶歪曲、散亂、變寬，說

21、明分離的效果不好，這與凝膠色譜柱的裝填有關。,3、你能觀察到蛋白質的分離過程中，紅色區(qū)帶的移動嗎？請描述紅色區(qū)帶的移動情況，并據(jù)此判斷分離效果？,三、實驗結果分析與評價,課題3 血紅蛋白的提取與分離,知識總結,血紅蛋白的提取和分離,教學反饋,1．凝膠色譜法是根據(jù)（ ）分離蛋白質的有效方法。 A分子的大小 B相對分子質量的大小 C帶電荷的多少 D溶解度2．

22、緩沖液的作用是：在一定范圍內，抵制外界的影響來維持（ ）基本不變。 A溫度 B pH C滲透壓 D氧氣濃度3．電泳是指帶電粒子在電場的作用下向著與其所帶電荷（ ）的電極移動。 A相同 B相反 C相對 D相向4. 哺乳動物和人的成熟的紅細胞中的（ ）與氧氣的運輸有關。

23、 A血紅蛋白 B肌紅蛋白 C肌動蛋白 D肌球蛋白,B,B,B,A,5．血液由血漿和各種血細胞組成，其中（ ）的含量最多。 A白細胞 B血小板 C紅細胞 D淋巴細胞6．為防止血液凝固，在采血容器中要預先加入抗凝血劑（ ）。 A. NaCl B.甲苯 C.蒸餾水 D.檸檬酸鈉7．將攪拌好的混合液轉移到離心管中，離心后，可以明顯看到試管中的溶液分為4層

24、，其中第3層是（ ） A無色透明的甲苯層 B脂溶性物質的沉淀層 C血紅蛋白的水溶液 D其他雜質的暗紅色沉淀物,C,D,C,練習鞏固,1、隨著人類跨入蛋白質組時代，對蛋白質的研究和應用越來越深入，首先要做的一步是A 弄清各種蛋白質的空間結構B 弄清各種蛋白質的功能C 弄清各種蛋白質的合成過程D 獲得高純度的蛋白質,2、用凝膠色譜法分離蛋白質的過程中，關于蛋白質的敘述，正確的是A 相對分子質量

25、較小的蛋白質行程大于相對分子質量較大的蛋白質B 相對分子質量較小的蛋白質行程小于相對分子質量較大的蛋白質C 相對分子質量較小的蛋白質行程等于相對分子質量較大的蛋白質D 二者根本無法比較,3、使用SDS-聚丙烯酰胺電泳過程中，不同蛋白質的電泳遷移率完全取決于A 電荷的多少 B 分子的大小C 肽鏈的多少 D 分子形狀的差異4、在采血容器中加入檸檬酸鈉的目的是A 調節(jié)pH