金銀花藥材指紋圖譜研究

1、1,1,中藥整體質(zhì)量控制的方法研究和趨勢(shì) 上海市食品藥品檢驗(yàn)所季 申2013.04 Address: 1500 Zhang Heng Road, Shanghai 201203, China Email: jishen200

2、8@gmail.com,2,,報(bào)告內(nèi)容,整體控制中藥質(zhì)量的必要性應(yīng)用一測(cè)多評(píng)等技術(shù)的問題和解決方案整體控制中藥質(zhì)量的展望,3,中藥整體質(zhì)量控制的必要性,中藥的特點(diǎn),值得肯定的是：企業(yè)對(duì)產(chǎn)品的安全性的重視，大部分中藥有一定的有效性和安全性，積累了很多的臨床和實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)。 中藥如何尋求平衡？中藥的前景？如何研究的思路？,,,中藥成分復(fù)雜難以全面控制全部成分同品種不同生產(chǎn)企業(yè)的生產(chǎn)設(shè)備難以完全一致藥材是天然產(chǎn)

3、品，難以保證質(zhì)量完全一致,思考：,4,中藥整體質(zhì)量控制的必要性,中藥質(zhì)量控制的發(fā)展歷程及趨勢(shì),發(fā)展歷程缺乏專屬性控制指標(biāo)單一成分到多成分的控制指標(biāo)成分到有效成分的控制,面臨的問題中藥成分的復(fù)雜性方法的專屬、可控、實(shí)用和經(jīng)濟(jì)有效性與安全性指標(biāo)的合理設(shè)置,發(fā)展趨勢(shì)從局部控制到整體控制多成分定量結(jié)合指紋圖譜的全方位中藥質(zhì)控新模式,解決方案物質(zhì)基礎(chǔ)的深入研究實(shí)現(xiàn)合理全面的質(zhì)量控制,,中藥整體質(zhì)量控制能夠反映中藥內(nèi)在質(zhì)量的整體

4、變化情況和質(zhì)量的均一程度，確保中藥質(zhì)量的均一穩(wěn)定。,中藥質(zhì)量控制面臨的問題及解決方案,,5,物質(zhì)基礎(chǔ)研究必要性,應(yīng)用一測(cè)多評(píng)等技術(shù)的問題和解決方案,制約中藥發(fā)展的瓶頸---易導(dǎo)致藥效作用機(jī)理,不良反應(yīng)發(fā)生等機(jī)制闡述不清建立全面可控的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)---建立更科學(xué)、合理、有效的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)中藥技術(shù)提升的關(guān)鍵---更好地闡明中藥作用機(jī)制等問題，促進(jìn)中醫(yī)藥理論創(chuàng)新及新藥的研發(fā),6,,中藥注射液質(zhì)量控制的模式(案例1）,闡明注射液總固體中的

5、成分,,,,,,,,黃芩,金銀花,,方法學(xué)認(rèn)證,,提取物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),注射劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),,明確注射液總固體含有的大類成分和單體成分,,,,,,,,,,山羊角,建立專屬性的分析方法,,,,,熊膽粉,,,連翹,保證中藥注射劑的安全性、穩(wěn)定性、有效性,明確5味提取物的物質(zhì)基礎(chǔ),,,,,,,,,,,,,,有效地控制中藥注射液內(nèi)在的質(zhì)量，運(yùn)用高效液相色譜法、質(zhì)譜法等技術(shù)手段，將闡明的化學(xué)成分納入質(zhì)量控制體系!,7,,,明確了8個(gè)成分 建

6、立了5種成分含量的專屬 性測(cè)定方法 5種成分含量約為干燥提取物的98%,,研究方法 研究成果,HPLC法 柱層析分離 Q-TOF液質(zhì) NMR等手段,,黃芩提取物,,8,,,,明確了黃芩提取物中的8個(gè)成分,,,,,,1,2,,3,,4,,5,6,7,8,,,黃芩提取物中約98％成分已明確結(jié)構(gòu),基本闡明了黃芩提取物的物質(zhì)基礎(chǔ)。,黃芩提取物的物質(zhì)基礎(chǔ)的研究,,9,,,分離得到4個(gè)已知化合物

7、明確了11個(gè)化合物結(jié)構(gòu) 有機(jī)酸類成分約為干燥提取物的28 % -39%,,研究方法 研究成果,HPLC（UV) HPLC-氨基柱 高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜HPLC,,金銀花提取物,,10,,,,,金銀花提取物質(zhì)譜總離子流圖,金銀花提取物物質(zhì)基礎(chǔ)的研究,金銀花提取物中有機(jī)酸類成分占28％-39％。,明確了金銀花提取物中的11個(gè)成分,11,,,分離得到2個(gè)已知化合物 建立12種成分含量測(cè)定方法 小

8、分子成分約占提取物10% 黃酮類成分約占提取物44%,,研究方法 研究成果,HPLC –DAD 多波長 HPLC –蒸發(fā)光檢測(cè)器 HPLC –離子阱質(zhì)譜 HPLC –QTOF質(zhì)譜 HPLC –示差檢測(cè)器 UV,,連翹提取物,,12,,,明確了連翹提取物中的12個(gè)成分,,,,1、連翹酯苷E2、連翹酯苷D3、咖啡酸4、組峰（連翹酯苷C及其同分異構(gòu)體）5、連翹酚1

9、（連翹酯苷A 的同分異構(gòu)體）6、蘆丁,7、異連翹酯苷A（連翹酯苷A 的同分異構(gòu)體）8、連翹酯苷A9、suspensaside A的同分異構(gòu)體10、suspensaside A的同分異構(gòu)體11、suspensaside A12、連翹苷,連翹提取物物質(zhì)基礎(chǔ)的研究,小分子成分總量約占干燥提取物近10%。,13,,,,連翹苷（C27H34O11）,蘆丁(C27H30O16),連翹酯苷C及其同分異構(gòu)體（C29H36O16）,suspe

10、nsaside A及其同分異構(gòu)體（C29H34O15）,連翹酚1（C29H36O15）,在藍(lán)圈處咖啡?；〈恢冒l(fā)生互換，或空間上立體構(gòu)型發(fā)生變化，都會(huì)產(chǎn)生異構(gòu)體。,14,,,得到31種氨基酸 建立12種氨基酸的檢測(cè)方法 蛋白氨基酸約為干燥提取物的70%存在焦谷氨酸,,研究方法 研究成果,高效液相色譜法 高效液相色譜柱前衍生法 液質(zhì)聯(lián)用同位素內(nèi)標(biāo)法 高分辨率質(zhì)譜,,山羊角提取物,,15,,

11、山羊角提取物物質(zhì)基礎(chǔ)的研究,,1、天冬氨酸 2、谷氨酸 3、絲氨酸,4、甘氨酸 5、蘇氨酸 6、丙氨酸,7、纈氨酸 8、苯丙氨酸 9、異亮氨酸,10、亮氨酸 11、脯氨酸,,11種蛋白氨基酸和焦谷氨酸的總量約占注射液總固體量的15%。,焦谷氨酸,,,明確了山羊角提取物中的11個(gè)成分,16,,,主要成分為熊去氧膽酸與鵝去氧膽酸 上述兩種成分總量占干燥提取物90％以上,,研究方法

12、 研究成果,紅外 核磁 制備薄層 高分辨率質(zhì)譜 HPLC（UV和 ELSD）,熊膽粉提取物,,17,,熊膽粉提取物,熊膽粉提取物物質(zhì)基礎(chǔ)的研究,注射液,注射液與熊膽粉提取物共有成分為熊去氧膽酸和鵝去氧膽酸,兩者總量約占注射液總固體量的33%。,熊去氧膽酸,鵝去氧膽酸,熊去氧膽酸,鵝去氧膽酸,18,,國食藥監(jiān)注[2007]743號(hào)文件《關(guān)于印發(fā)中藥、天然藥物注射劑基本技術(shù)要求的通知》,總固體的80％成分可

13、測(cè)總固體的60％成分明確結(jié)構(gòu)并采用專屬性方法可測(cè)明確結(jié)構(gòu)成分中的90％在指紋圖譜中可指認(rèn),技術(shù)要求,19,,注射液物質(zhì)基礎(chǔ)研究結(jié)果,,A：總固體中可測(cè)成分B：總固體中明確結(jié)構(gòu)并采用專屬性方法可測(cè)成分C：明確結(jié)構(gòu)并可在指紋圖譜中指認(rèn)成分,,闡明的物質(zhì)基礎(chǔ)和質(zhì)量控制已滿足國家的有關(guān)技術(shù)要求,,20,,,注射液指紋圖譜,,,,,,,,,,,,,,,指紋圖譜1,指紋圖譜2,1、新綠原酸； 2、綠原酸；3、隱綠原酸； 4、咖

14、啡酸；5、3，4’－二咖啡酸?？崴?、3，5’－二咖啡酸?？崴?、4，5’－二咖啡酸?？崴幔?、連翹酯苷D； 9、野黃芩苷,1、野黃芩苷； 2、黃芩苷； 3、千層紙素-7-O-葡萄糖醛酸苷 4、白楊素-7-O-葡萄糖醛酸苷,21,,,,注射液指紋圖譜,,,,,,,,,,,,,,指紋圖譜4,1、天冬氨酸； 2、谷氨酸；3、絲氨酸； 4、甘氨酸；5、蘇氨酸； 6、丙氨酸；7、纈氨酸；

15、 8、苯丙氨酸；9、異亮氨酸； 10、亮氨酸； 11、脯氨酸,熊去氧膽酸,鵝去氧膽酸,,,,可指認(rèn)成分達(dá)到明確結(jié)構(gòu)成分的93％,指紋圖譜3,22,在多指標(biāo)( s，a，b，…) 質(zhì)量評(píng)價(jià)時(shí)，以某一典型有效成分作為內(nèi)參物( s) ，建立內(nèi)參物與其它待測(cè)成分( a，b，…） 間的相對(duì)校正因子( RCF，fsa，fsb…) 通過相對(duì)校正因子達(dá)到測(cè)定一個(gè)成分( 對(duì)照品可得到者)的同時(shí) , 可計(jì)算出其它待測(cè)有效成分的含量,,什么是“一測(cè)

16、多評(píng)”（QAMS）？,,一測(cè)多評(píng)技術(shù)在中藥質(zhì)量控制中的應(yīng)用,23,采用“一測(cè)多評(píng)”的理由：物質(zhì)基礎(chǔ)研究表明：具有7種有機(jī)酸類：金銀花提取物中含綠原酸、咖啡酸、隱綠原酸、新綠原酸、4，5－二咖啡酸?？崴帷?，4－二咖啡酸?？崴?、3，5－二咖啡酸?？崴峁?種有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品的缺乏：除咖啡酸和綠原酸具有標(biāo)準(zhǔn)品外，其余標(biāo)準(zhǔn)品缺乏具有綠原酸的母核：除咖啡酸外，其余6種有機(jī)酸結(jié)構(gòu)類似，均具有綠原酸的母核含量范圍相近：含量范圍為0.02～

17、0.07mg/ml,,金銀花提取物中總有機(jī)酸含量的主要方法學(xué)研究（案例2）,,內(nèi)參物的選擇依據(jù)：具有相同母核的有機(jī)酸---綠原酸,24,波長的選擇（金銀花中的有機(jī)酸類最大吸收波長均在325nm ）流動(dòng)相組成的考察流動(dòng)相梯度的考察柱溫及流速的考察不同色譜柱的考察不同儀器的考察,方法中明確了色譜柱等可能影響相對(duì)保留時(shí)間的因素方法允許流動(dòng)相比例可以調(diào)節(jié)，并保證分離效果，以適應(yīng)中藥材批次間的合理差異,HPLC 分析方法的研究,25,

18、,金銀花提取物高效液相色譜圖,新綠原酸,綠原酸,隱綠原酸,咖啡酸,3，4’－二咖啡酸?？崴?3，5’－二咖啡酸?？崴?4.5’－二咖啡酸酰奎尼酸,金銀花提取物色譜峰指認(rèn),金銀花提取物中有機(jī)酸類成分占28％-39％,26,,相對(duì)校正因子的確定,相對(duì)校正因子的確定需要大量，全面的數(shù)據(jù)考察不同濃度范圍不同來源或批號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)品考察不同儀器的考察,以17個(gè)相對(duì)校正因子的平均值作為各有機(jī)酸成分的相對(duì)校正因子,27,,,1、新綠原酸 2、連

19、翹酯苷D3、綠原酸 4、隱綠原酸 5、咖啡酸6、野黃芩苷7、3，4－二咖啡酸?？崴?8、3，5－二咖啡酸酰奎尼酸 9、4，5－二咖啡酸?？崴?避免不同批次樣品中除目標(biāo)色譜峰外雜質(zhì)峰的影響避免目標(biāo)色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間漂出標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的范圍（±5）采用指紋圖譜指認(rèn)峰的方法實(shí)現(xiàn)目標(biāo)峰的確認(rèn)（峰1、3、4、5、7、8、9）,考察不同色譜柱，不同儀器的影響結(jié)合DAD光譜、指紋圖譜（特征

20、圖譜）等多種方式對(duì)待測(cè)目標(biāo)色譜峰以相對(duì)保留時(shí)間進(jìn)行指認(rèn),待測(cè)目標(biāo)色譜峰的定位（保證QAMS法應(yīng)用的前提）,28,一測(cè)多評(píng)計(jì)算結(jié)果與實(shí)測(cè)結(jié)果表（單位：mg/ml）,采用一測(cè)多評(píng)測(cè)得的結(jié)果與實(shí)際測(cè)得結(jié)果基本一致，表明建立的方法：相對(duì)校正因子準(zhǔn)確，方法可行。,,,準(zhǔn)確度、精密度、專屬性、定量限、檢測(cè)限、線性范圍、耐用性等，外標(biāo)法和一測(cè)多評(píng)法結(jié)果的比較。,其他方法學(xué)考察,29,研究背景 處方中的大黃含有大黃素、大黃酚、蘆薈大黃素、大黃素甲醚，

21、大黃酸等蒽醌類物質(zhì)，化學(xué)結(jié)構(gòu)相似擬采用一測(cè)多評(píng)的方法進(jìn)行蒽醌類物質(zhì)的含量測(cè)定,,制劑中蒽醌類物質(zhì)的含量測(cè)定（案例3）,遇到的問題：不同分析儀器會(huì)造成相對(duì)保留時(shí)間的差異缺乏合理的內(nèi)參物同時(shí)指認(rèn)目標(biāo)色譜峰以大黃素為內(nèi)參物，采用不同儀器所得蘆薈大黃素和大黃酸的相對(duì)保留時(shí)間偏差較大（大于15％）,,30,解決方案：分別選擇合理的內(nèi)參物蘆薈大黃素以大黃酸為內(nèi)參物大黃酚、大黃酸和大黃素甲醚以大黃素為內(nèi)參物,,相對(duì)保留時(shí)間,供試品色譜圖,

22、,相關(guān)系數(shù)達(dá)到了預(yù)期的效果,,,,31,,丹參藥材供試品溶液色譜圖,“丹參”中丹參酮類物質(zhì)的含量測(cè)定（案例4）,研究背景 ：收入美國藥典的復(fù)核丹參中含有丹參酮IIA、隱丹參酮、丹參酮I等化合物，結(jié)構(gòu)類似，符合一測(cè)多評(píng)的要求以丹參酮IIA作為內(nèi)參物，測(cè)定隱丹參酮、丹參酮I的含量,,,丹參酮類相同母核,32,復(fù)核中發(fā)現(xiàn)檢測(cè)波長的帶寬也會(huì)影響相對(duì)校正因子，提醒實(shí)驗(yàn)室在進(jìn)行相對(duì)校正因子的考察時(shí)應(yīng)予以考慮波長的帶寬！,,,發(fā)現(xiàn)的問題： 不同

23、品牌色譜柱會(huì)引起相對(duì)保留時(shí)間的改變，甚至出現(xiàn)出峰順序顛倒解決方案：質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中明確色譜柱類型,,,33,適用于結(jié)構(gòu)類似的同系物同系物紫外光譜圖相似度高，在相同波長處的吸收度相差小，即校正因子相差小同系物相對(duì)校正因子不會(huì)因?yàn)榱鲃?dòng)相的比例微調(diào)而發(fā)生變化目標(biāo)色譜峰定位是關(guān)鍵全面的考察各種可能影響色譜峰相對(duì)保留時(shí)間的因素，不同品種可能的影響因素有差異，應(yīng)在質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中分別予以明確規(guī)定需以相對(duì)保留時(shí)間結(jié)合DAD光譜、指紋圖譜（特征圖譜

24、）等多種方式對(duì)待測(cè)目標(biāo)色譜峰進(jìn)行指認(rèn)相對(duì)校正因子的確定需要大量的考察全面的數(shù)據(jù)考察基于工藝穩(wěn)定的產(chǎn)品，避免由于不同批次的不穩(wěn)定帶來的系數(shù)變化,,,“一測(cè)多評(píng)”技術(shù)應(yīng)用中應(yīng)注意的問題,,,,34,制劑中由于有其他藥味的干擾，可能會(huì)影響目標(biāo)色譜峰的分離調(diào)整分離效果時(shí)，會(huì)出現(xiàn)目標(biāo)色譜峰相對(duì)保留時(shí)間發(fā)生偏差的現(xiàn)象相鄰色譜峰在定位時(shí)會(huì)引起混淆,,建議解決方案：配合指紋圖譜或者特征圖譜進(jìn)行色譜峰確認(rèn)，避免有關(guān)問題。,制劑中應(yīng)用一測(cè)多評(píng)技