細胞培養(yǎng)相關(guān)技術(shù)

1、細胞培養(yǎng)相關(guān)技術(shù)講座 石春薇 2011年12月21日,細胞培養(yǎng) Cell culture轉(zhuǎn)染 Transfection免疫熒光染色 Immunofluorescence staining,體外培養(yǎng)細胞的特性,培養(yǎng)細胞的生長方式 貼附生長：必須貼附于支持物表面才能生長，如各種實體瘤細胞。

2、 懸浮生長：于懸浮狀態(tài)下即可生長，不需要貼附于支持物表面，如各種造血系統(tǒng)腫瘤細胞。,細胞培養(yǎng)：模擬體內(nèi)的生理環(huán)境，在無菌、適溫和豐富的營養(yǎng)條件下，使離體細胞生存、生長并維持結(jié)構(gòu)和功能的一門技術(shù)。,基本概念,原代培養(yǎng) 動物或人組織直接用蛋白酶消化所得的細胞經(jīng)體外培養(yǎng)后可貼壁或懸浮生長，在傳代之前稱為原代培養(yǎng)。傳代 細胞在培養(yǎng)器皿中生長一定時間后，被分開接種到新的培養(yǎng)器皿中。細胞系 cell line 原代培

3、養(yǎng)物成功傳代后，則稱之為細胞系。如細胞系的生存期有限，則稱之為有限細胞系（finite cell line）；已獲無限繁殖能力能持續(xù)生存的細胞系，稱連續(xù)細胞系或無限細胞系（infinite cell line）。無限細胞系大多已發(fā)生異倍化，具異倍體核型，有的可能已成為惡性細胞，因此本質(zhì)上已是發(fā)生轉(zhuǎn)化的細胞系。 細胞株 cell strain 從一個經(jīng)過生物學鑒定的細胞系用單細胞分離培養(yǎng)或通過篩選的方法，由單細胞增殖形成的細胞群，稱

4、細胞株。通常將具有特殊性質(zhì)或標志物的細胞群稱為細胞株。,美國標準細胞庫或細胞銀行（ATCC）和人遺傳突變細胞庫（HGMR）、細胞衰老細胞庫（CAR）等ATCC不僅是美國，也是世界最大的細胞庫，是世界衛(wèi)生組織WHO的國際培養(yǎng)細胞文獻中心ATCC現(xiàn)液氮凍存有3200個已經(jīng)過鑒定的細胞系，接納來自世界各國已經(jīng)鑒定的細胞予以貯存，同時也向世界各國的研究者或?qū)嶒炇颐赓M提供研究用細胞（做盈利性研究時收費）武漢大學細胞典藏物中心,細胞典藏物中心

5、,每代貼附生長細胞的生長過程,游離期貼壁期潛伏期對數(shù)生長期停止期（平臺期）,游離期：細胞接種后在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)．也稱懸浮期。此時細胞質(zhì)回縮，胞體呈圓球形。10分鐘一4小時,貼壁期：細胞附著于底物上，游離期結(jié)束。細胞株平均在10分鐘一4小時貼壁。底物：膠原、玻璃、塑料、其它細胞等血清中有促使細胞貼壁的冷析球蛋白和纖粘素、膠原等糖蛋白（生長基質(zhì)），這些帶正電荷的糖蛋白的促貼壁因子先吸附于底物上，懸浮細胞再與吸附有促

6、貼壁因子的附著。進口塑料培養(yǎng)瓶涂有生長基質(zhì)（化學合成的功能基團）,潛伏期此時細胞有生長活動，而無細胞分裂。細胞株潛伏期一般為6～24小時。,對數(shù)生長期：細胞數(shù)隨時間變化成倍增長，活力最佳，最適合進行實驗研究。,停止期（平臺期）：細胞長滿瓶壁后，細胞雖有活力但不再分裂機制：接觸抑制、密度依賴性,細胞培養(yǎng)方式,群體培養(yǎng)（mass culture），將含有一定數(shù)量細胞的懸液置于培養(yǎng)瓶中，讓細胞貼壁生長，匯合后形成均勻的單

7、細胞層克隆培養(yǎng)（clonal culture），將高度稀釋的游離細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中，各個細胞貼壁后，彼此距離較遠，經(jīng)過生長增殖每一個細胞形成一個細胞集落，稱為克?。╟lone）。一個細胞克隆中的所有細胞均來源于同一個祖先細胞。,群體培養(yǎng)（左）和克隆培養(yǎng)（右）,培養(yǎng)細胞生長的條件,無污染環(huán)境: 生物安全柜，超凈工作臺基質(zhì): 玻璃，塑料…營養(yǎng)需要: 氨基酸，碳水化合物，無機鹽，緩沖系統(tǒng)，維生素 … (商業(yè)化合成培養(yǎng)基) pH

8、: 7.2-7.4溫度: 37 ℃，細胞培養(yǎng)箱氣體環(huán)境 O2 CO2: 5% CO2 +H2O ← →H2CO3 ← →H+ + HCO3-,實驗準備,實驗用品：超凈工作臺，壓力蒸汽消毒器，電熱干燥箱，濾器，酸缸，紫外燈，甲醛熏蒸器CO2培養(yǎng)箱倒置顯微鏡酶標儀、微孔板震蕩器液氮罐自動雙重純水蒸餾器，純水儀耗材：培養(yǎng)瓶，吸管，電動移液器，培養(yǎng)板， 凍存管。。。,

9、CO2培養(yǎng)箱,CO2培養(yǎng)箱設(shè)定的條件為37 ℃ ，5％CO2 。 使用CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)細胞時應注意的問題： ①用螺旋口瓶培養(yǎng)細胞時，需將瓶蓋微松，以保證通氣。 ②保持培養(yǎng)箱內(nèi)空氣干凈。定期消毒（90 ℃ ，14 h或者紫外殺菌)。 ③箱內(nèi)置4-6 L蒸餾水，加入100ml飽和硫酸銅溶液，以保持箱內(nèi)濕度，避兔培養(yǎng)液蒸發(fā)，并抑制真菌污染。,實驗物品準備 常用玻璃器皿清洗浸泡（自來水）、刷洗

10、（洗衣粉）、泡酸（24小時）、流水沖洗、蒸溜水浸泡和沖洗、50℃烘干,清潔液的配制,細胞培養(yǎng)用液的配制水：新鮮配置的三蒸水或去離子水平衡鹽溶液：無Ca2+、Mg2+的緩沖液 PBS：NaCl 8.0 g KCl 0.2 g Na2HPO4.

11、H2O 1.56 g KH2PO4 0.20 加水至1000 ml,,消化液胰蛋白酶作用于與賴氨酸或精氨酸相連接的肽健，除去細胞間粘蛋白及糖蛋白，影響細胞骨架，從而使細胞分離。 胰蛋白酶液濃度越高，作用越強，但超過一定限度會損傷細胞。胰蛋白酶是一種黃白色粉末，用無Ca2+、Mg2+的P

12、BS緩沖液配制常用的胰蛋白酶液濃度是0.25％ 。用濾器過濾除菌。胰蛋白酶液消化時間：2-10分鐘。用含血清培養(yǎng)液終止其對細胞的消化作用,培養(yǎng)基,培養(yǎng)基（培養(yǎng)液）是維持體外細胞生存和生長的溶液，分天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基。合成培養(yǎng)基：根據(jù)細胞生存所需物質(zhì)的種類和數(shù)量，用人工方法模擬合成的。目前已設(shè)計出許多種培養(yǎng)基，如TC199、MEM、RPMI-1640、 DMEM等。人工合成培養(yǎng)基只能維持細胞生存，要想使細胞生長和繁殖，

13、還需補充一定量的天然培養(yǎng)基（如血清）。,血清中含有：多種蛋白質(zhì)（白蛋白、球蛋白、鐵蛋白等）多種金屬離子激素促貼附物質(zhì)，如纖粘蛋白、冷析球蛋白、膠原等各種生長因子轉(zhuǎn)移蛋白不明成分一般說來，含5％小牛血清的培養(yǎng)基對大多數(shù)細胞可以維持細胞不死，但支持細胞生長一般需加 10％血清。,常用血清有胎牛血清、新生牛血清、小牛血清、兔血清、馬血清等，其中以胎牛血清質(zhì)量最好。優(yōu)質(zhì)血清的標準：透明，淡黃色，無沉淀物，無細菌、支原體、病毒

14、污染。血清的滅活（消除補體活性）：56 ℃ ，30 分鐘血清的消毒：過濾除菌,抗生素的使用在培養(yǎng)液配制后，培養(yǎng)液內(nèi)常加適量抗菌素，以抑制可能存在的細菌的生長。通常是青霉素和鏈霉素聯(lián)合使用。培養(yǎng)基內(nèi)青霉素、鏈霉素最終使用濃度為每毫升100單位。慶大霉素：每毫升100單位——方便、廣譜、穩(wěn)定,完全培養(yǎng)基的組成,基礎(chǔ)培養(yǎng)基 80％一95％血清

15、 5％一20％碳酸氫鈉 2.0 g/L青、鏈霉素 各100單位／毫升,細胞培養(yǎng)基本方法（無菌原則）,無菌工作臺用75%酒精擦拭干凈，紫外線照射40分鐘以上。清洗雙手及手腕，戴乳膠手套，然后用75%酒精擦拭。操作時注意無菌臺內(nèi)空間層次。整個操作過程盡量在無菌臺靠里面一點。手及物品不要在暴露的瓶口上方來往，嚴格注意無菌操作

16、。,細胞傳代方法,根據(jù)細胞生長的特點，傳代方法有3種。懸浮生長細胞傳代 離心法傳代：離心（1000轉(zhuǎn)/分）去上清，沉淀物加新培養(yǎng)液后再混勻傳代。半懸浮生長細胞傳代 此類細胞部分呈現(xiàn)貼壁生長現(xiàn)象，但貼壁不牢，可用直接吹打法使紉胞從瓶壁脫落下來，進行傳代。貼壁生長細胞傳代 采用酶消化法傳代。常用的消化液有0.25％的胰蛋白酶液。,貼壁生長細胞傳代方法,吸光培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液適量PBS洗凈殘留培養(yǎng)液

17、加入1-2 ml 0.25％的胰蛋白酶液(以消化液能覆蓋整個瓶底為準）靜置2-10 min（顯微鏡下動態(tài)監(jiān)測）加入培養(yǎng)液，終止胰酶消化作用用吸管吸取瓶內(nèi)培養(yǎng)液，反復吹打瓶壁細胞，形成細胞懸液吸取1/3細胞懸液，接種于新的培養(yǎng)瓶內(nèi)加適量新鮮培養(yǎng)液于接種了細胞懸液的新培養(yǎng)瓶內(nèi)將后者放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng),細胞凍存和復蘇,細胞低溫冷凍貯存是細胞室的常規(guī)工作。細胞凍存與細胞傳代保存相比可以減少入力、經(jīng)費，減少污染，減少細胞生物學特性變化。

18、,凍存和復蘇的原則：慢凍快融,當細胞冷到零度以下，可以產(chǎn)生以下變化：細胞器脫水，細胞中可溶性物質(zhì)濃度升高，并在細胞內(nèi)形成冰晶。 如果緩慢冷凍，可使細胞逐步脫水，細胞內(nèi)不致產(chǎn)生大的冰晶；相反．結(jié)晶就大，大結(jié)晶會造成細胞膜、細胞器的損傷和破裂。復蘇過程應快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重結(jié)晶。,慢凍程序,標準程序： 當溫度在-25 ℃以上時， 1～2 ℃/min

19、 當溫度達-25 ℃以下時， 5～10 ℃/min 當溫度達-100℃時，可迅速放入液氮中 細胞凍存器簡易程序： 將冷凍管（管口要朝上）放入紗布袋內(nèi)，紗布袋系以線繩，通過線繩將紗布袋固定于液氮罐罐口，按每分鐘溫度下降1～2 ℃的速度，在40分鐘內(nèi)降至液氮表面，停30分鐘后，直接投人液氮中。,低溫保護劑的應用,在細胞凍存時加入低溫保護劑，能大大提高凍存效果。

20、常用的低溫保護劑是DMSO，它是一種滲透性保護劑，可迅速透入細胞，提高細胞膜對水的通透性，降低冰點，延緩凍結(jié)過程，能使細胞內(nèi)水分在凍結(jié)前透出細胞外，在細胞外形成冰晶，減少細胞內(nèi)冰晶，從而減少冰晶對細胞的損傷。,細胞凍存方法,預先配制凍存液： 含20%血清培養(yǎng)基 10% DMSO 取對數(shù)生長期細胞，經(jīng)胰酶消化后，加入適量凍存液，用吸管吹打制成細胞懸液（1

21、5;106 ～ 5 ×106細胞/ml)加入1ml細胞于凍存管中，密封后標記冷凍細胞名稱和冷凍日期,細胞復蘇方法,從液氮中取出冷凍管，迅速投入37～38 ℃水浴中，使其融化（1分鐘左右）。5分鐘內(nèi)用培養(yǎng)液稀釋至原體積的10倍以上。低速離心10分鐘。去上清，加新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)剛復蘇的細胞。,細胞計數(shù),血細胞計數(shù)板計數(shù)儀 Counter,血球計數(shù)盤一般有二個chambers，每個chamber 中細刻9 

22、;個1 mm2大正方形，其中4 個角落之正方形再細刻16 個小格，深度均為0.1 mm。當chamber 上方蓋上蓋玻片后，每個大正方形之體積為1 mm2 x 0.1 mm=1.0 x 10-4 ml。使用時，計數(shù)每個大正方形內(nèi)之細胞數(shù)目，乘以稀釋倍數(shù)，再乘以104，即為每ml 中之細胞數(shù)目。,培養(yǎng)細胞活力測

23、定,臺盼藍法，trypan blue， 利用染料會滲入死細胞中而呈色，而活細胞因細胞膜完整，染料無法滲入而不會呈色。用活細胞占細胞中的百分比表示細胞活力MTT法,轉(zhuǎn)染 (Transfection),將具生物功能的核酸轉(zhuǎn)移或運送到細胞內(nèi)并使核酸在細胞內(nèi)維持其生物功能 常特指將質(zhì)?；蛞运鼈?yōu)檩d體構(gòu)建的重組子導入真核細胞的過程。,轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)化的區(qū)別,轉(zhuǎn)化特指將質(zhì)粒DNA或以其為載體構(gòu)建的重組DNA導入細菌體內(nèi)，使之獲得新

24、的遺傳特性的一種方法。,瞬時轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染,瞬時轉(zhuǎn)染，外源DNA/RNA不整合到宿主染色體中，因此一個宿主細胞中可存在多個拷貝數(shù)，產(chǎn)生高水平的表達，但 通常只持續(xù)幾天。一般來說，在轉(zhuǎn)染后24-96小時內(nèi)檢測和分析結(jié)果。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，也稱永久轉(zhuǎn)染，外源DNA整合到宿主染色體中。外源DNA整合到染色體中概率很小，大約1/104轉(zhuǎn)染細胞能整合，通常需要通過選擇性標記篩選，如抗生素篩選APH（新霉素抗性基因）， HPH （潮霉素）， TK（胸苷激

25、酶）等反復篩選，得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的同源細胞系。,影響轉(zhuǎn)染效率的因素,細胞培養(yǎng)物 健康的細胞 低的細胞代數(shù)（<50）能確保基因型不變 一定的細胞密度 推薦在轉(zhuǎn)染前24小時內(nèi)分細胞，這將提供正常細胞代謝，增加對外源DNA攝入的可能,血清 血清是一種包含生長因子及其它輔助因子的不確切成分的添加物，對不同細胞的生長作用有很大的差別。血清質(zhì)量的變化直接影響轉(zhuǎn)染效率。有些轉(zhuǎn)染技術(shù)如脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染在有血清存在情況下效

26、率很低，因此在轉(zhuǎn)染前要除血清。,DNA質(zhì)量 一般的轉(zhuǎn)染技術(shù)（如脂質(zhì)體等）基于電荷吸引原理，如果DNA不純，如帶少量的鹽離子、蛋白、代謝物污染都會顯著影響轉(zhuǎn)染復合物的有效形成及轉(zhuǎn)染的進行。核酸純化世界第一品牌德國QIAGEN公司提供的超純質(zhì)粒抽提試劑盒，能達到兩倍2xCsCl梯度離心以上的純度效果，使DNA質(zhì)量得到保證。對一些內(nèi)毒素敏感的細胞（如原代細胞，懸浮細胞和造血細胞），QIAGEN還提供可去除內(nèi)毒素污染的質(zhì)粒抽提試劑盒，在質(zhì)

27、粒抽提過程中有效去除脂多糖分子，保證理想的轉(zhuǎn)染效果。,6孔板轉(zhuǎn)染實驗步驟,轉(zhuǎn)染前18至24小時內(nèi)接種2×105細胞至每孔內(nèi)（細胞濃度1×105/ml，每孔接種2ml，全培養(yǎng)基培養(yǎng)，無抗生素），轉(zhuǎn)染前4小時更換培養(yǎng)基對每孔細胞，稀釋2ug DNA于250 ul OptiMEM 對每孔細胞，稀釋4 ul Lipofectamine 2000于250 ul OptiMEM，室溫孵育 5 min將步驟2和步驟3中的DN

28、A懸液和 Lipofectamine 2000 懸液均勻混勻，室溫孵育20 min以使 DNA- Lipofectamine 2000復合物形成將 DNA- Lipofectamine 2000 complexes (500 ul) 直接輕柔的滴加到每孔細胞中，輕柔搖勻,免疫熒光染色 IF,免疫熒光組織（細胞）化學技術(shù)，是采用熒光素標記的已知抗體 （或抗原）作為探針，檢測待測組織、細胞標本中的靶抗原（或抗體），形成的抗原抗體

29、復合物上帶有熒光素，在熒光顯微鏡下，由于受紫外光照射，熒光素發(fā)出明亮的熒光，這樣就可以分辨出抗原（或抗體）的所在位置及其性質(zhì)。,直接法：將熒光素標記在相應的抗體上，直接與相應抗原反應。其優(yōu)點是方法簡便、特異性高，非特異性熒光染色少。缺點是敏感性偏低；而且每檢查一種抗原就需要制備一種熒光抗體。 間接法：特異性的一抗和熒光素標記的二抗,F-actin直接染色,中文名稱：鬼筆環(huán)肽 英文名稱：phalloidin 定義：由鬼筆鵝膏真菌（A

30、manita phalloides）產(chǎn)生的一種環(huán)肽。可與F肌動蛋白結(jié)合，使F肌動蛋白保持穩(wěn)定。其熒光標記物是鑒定F肌動蛋白的重要試劑。,GFP TRITC-phalloidin DAPI 07.23.10,58,60,61,62,64,65,80,81,82,間接免疫熒光染色,制片細胞接種固定破膜封閉染色封片和熒光顯微鏡觀察

31、,制片,Chamber slide：腔室玻璃系統(tǒng)Coverslip：蓋玻片（酒精，紫外照射滅菌）玻片包被：膠原，纖維蛋白fibronectin，整合素intergrin，vitronectin… *有些基質(zhì)蛋白是與細胞內(nèi)某些信號通路相關(guān)的,Chamber slide,細胞接種,根據(jù)不同的研究內(nèi)容和實驗目的，選擇不同細胞密度進行接種和生長時間染色前用溫熱的PBS洗去培養(yǎng)基（含Ca2+、Mg2+ 或者不含Ca2+、Mg2+

32、的PBS的選擇）,固定,根據(jù)需要選擇適當?shù)墓潭▌┕潭毎?，?% 多聚甲醛 固定15分鐘多聚甲醛宜現(xiàn)用現(xiàn)配，或配好后分裝-20 ℃ 凍存，用之前37 ℃復溫固定完畢后的細胞可置于含疊氮納的PBS中4℃保存3個月PBS洗滌3×5 min,破膜或通透,在檢測細胞內(nèi)抗原表位的時候需要對細胞進行通透處理，因為抗體需要進入細胞內(nèi)部去檢測蛋白如果待檢測的是跨膜蛋白，且其抗原表位處于胞質(zhì)內(nèi)區(qū)域，則同樣需要對細胞進行通透如果所檢測的

33、抗原表位位于膜蛋白的胞外段，則不需要進行通透。常用的通透劑是去垢劑，如Triton ，NP-40，以及Tween 20，Saponin，Digitonin 和 Leucoperm等。Triton和NP-40屬于烈性去垢劑，可部分溶解細胞核膜，因此非常適合核抗原檢測。但應該注意的是，如果在高濃度下使用或者作用時間過長，它們將破壞蛋白，從而影響實驗結(jié)果。Triton X-100是最常用的通透劑，但是它將破壞細胞膜，因此不適用于細胞膜相關(guān)

34、抗原。后面一組去垢劑要溫和得多，它們可以在細胞質(zhì)膜上形成足夠大的孔隙以允許抗體通過，但是不會溶解細胞質(zhì)膜。適于胞質(zhì)抗原或者質(zhì)膜上靠近胞質(zhì)一面的抗原，也適于可溶性的核抗原。,封閉,PBST + 1% BSA，室溫，1h,抗體孵育,為保證結(jié)合質(zhì)量和防止干燥，抗體孵育應盡量在濕盒中進行。 二抗是熒光抗體，因此孵育時注意避光 一抗室溫孵育1h，PBST洗滌3×5mim二抗室溫孵育1h，PBST洗滌3×5mim核染：

35、可在PBST第二次洗滌時在PBST中加入核染料如DAPI（儲存液用蒸餾水配成1mg/ml的濃度，使用終濃度一般為0.5 ~1μg/ml ）,封片及熒光觀察,為了保存結(jié)果，以便進一步觀察、照像、統(tǒng)計分析等，需作封片（mounting）處理常規(guī)的方法是采用甘油或中性樹脂封片，為了增強封片的效果，往往需要在封片時添加特殊的抗熒光淬滅劑 商業(yè)化的Mounting buffer有的已含有DAPI，染核在封片時即完成,抗體選擇,GFP + TR