控制水稻花期OsEF1基因功能的研究.pdf

1、水稻是世界上最重要的糧食作物之一,也是研究禾本科植物和單子葉植物研究的模式作物。隨著水稻基因組測(cè)序的完成,大量水稻突變庫(kù)的創(chuàng)建,加快了水稻理論研究的步伐,明顯縮短了基因克隆的周期,使水稻基因功能的研究進(jìn)入了后基因組研究的時(shí)代。近年來(lái),許多重要農(nóng)藝性狀的基因被成功的克隆,如花期、育性、葉形、抗病性等。開(kāi)花時(shí)間,在水稻中又稱(chēng)抽穗期,是營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)向生殖生長(zhǎng)的過(guò)渡,所以對(duì)控制水稻開(kāi)花基因的克隆,將有助于理解和完善水稻控制開(kāi)花的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及分子基礎(chǔ),

2、擴(kuò)大水稻適應(yīng)性栽培的范圍,為育種工作的開(kāi)展提供重要的遺傳基礎(chǔ)和理論指導(dǎo)。
　　 本文研究的材料基于實(shí)驗(yàn)室創(chuàng)建的10萬(wàn)份水稻突變體庫(kù)中篩選到的一個(gè)早花突變體Osef1,基于前期側(cè)翼序列的擴(kuò)增、互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)等證明了該突變體是Tosl7插入到OsEF1基因的3’UTR失活引起的；亞細(xì)胞定位在細(xì)胞核中；構(gòu)建pBDGAL4cam-EF1融合載體,利用酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)篩選出了35個(gè)與OsEF1互作的蛋白；明確了長(zhǎng)日照下,OsEF1起著正調(diào)控Hd1

3、和負(fù)調(diào)控Ehd1的作用等基礎(chǔ)上進(jìn)行深入研究的。
　　 首先,通過(guò)田間農(nóng)藝性狀的調(diào)查發(fā)現(xiàn)在自然長(zhǎng)日照條件下,Osef1突變體開(kāi)花時(shí)間明顯早于野生型,時(shí)間早30d左右,同時(shí),突變體呈現(xiàn)半矮化的表型。
　　 其次,研究了OsE目的組織表達(dá)模式。通過(guò)轉(zhuǎn)pPosEF1-GUS陽(yáng)性植株的GUS活性分析,發(fā)現(xiàn)OsEF1在根、莖、葉、幼穗、穎殼、側(cè)根、結(jié)節(jié)、葉鞘、葉枕都有表達(dá),石蠟包埋切片在葉片和葉鞘的各個(gè)類(lèi)型的細(xì)胞中也檢測(cè)到了GUS活

4、性,表明了OsEF1是一個(gè)組成性表達(dá)基因。同時(shí)利用Quantitative Real-Time PCR對(duì)上述組織進(jìn)行相對(duì)定量分析,得出了類(lèi)似的結(jié)論。
　　 第三,通過(guò)Quantitative Real-Time PCR開(kāi)展OsEF1光周期節(jié)律性分析。研究發(fā)現(xiàn)在短日照下,OsE目的表達(dá)貫穿整個(gè)白天和晚上,在黑夜之前有一個(gè)最低值,在光照之前出現(xiàn)峰值,從而可以推斷OsEF1是受光周期調(diào)控的基因,mRNA的表達(dá)呈晝夜節(jié)律性表達(dá)。

5、　　 第四,為了更好的研究OsEF1蛋白的靶基因,將酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)篩選出的8個(gè)與OsEF1互作蛋白的基因進(jìn)行RNAi干涉。主要利用Gateway系統(tǒng)和pTCK309載體,成功的構(gòu)建了RNAi載體,其中Gateway系統(tǒng)構(gòu)建了7個(gè)載體,以pTCK309載體為骨架的2個(gè),將上述干涉載體通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化日本晴,其中一個(gè)基因的轉(zhuǎn)化群體中有3株表現(xiàn)早開(kāi)花性狀。
　　 最后,原核表達(dá)和純化OsEF1蛋白及制備多克隆抗體。將OsEF1全

6、長(zhǎng)cDNA融合到pET-32A載體上,經(jīng)0.4mM的IPTG誘導(dǎo)8h,成功的表達(dá)可溶性蛋白；His標(biāo)簽蛋白的Western Blot檢測(cè)證明了表達(dá)的總蛋白即為目的蛋白；在非變性條件下,通過(guò)His鎳柱小量親和純化發(fā)現(xiàn)1.50mM的咪唑濃度較為適宜,大規(guī)模純化并初定量后獲得3mg蛋白,用于制備多克隆抗體,以進(jìn)一步檢測(cè)突變體背景下內(nèi)源蛋白水平的研究。OsEF1基因的克隆及功能的深入研究,說(shuō)明了水稻在光周期調(diào)控方面形成了獨(dú)特和復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò),與擬南