第四章 生物樣品的采集、儲(chǔ)存及預(yù)處理

1、73第四章生物樣品的采集、儲(chǔ)存及預(yù)處理第一節(jié)生物樣品的采集、儲(chǔ)存體內(nèi)藥物分析的任務(wù)和分析對(duì)象具有如下特點(diǎn):被測(cè)定的藥物和代謝物的濃度極低；樣品介質(zhì)復(fù)雜，其中存在各種各樣直接或間接影響測(cè)定結(jié)果的物質(zhì)，大多需要分離和凈化；僅有少量樣品可供分析，尤其是在連續(xù)測(cè)定過(guò)程中，很難再度獲得完全相同的樣品；樣品的穩(wěn)定性需要特別注意等。一、生物樣品的采集生物介質(zhì)(biologicalmatrix)包括全血、血漿、血清、尿、糞、唾液和各種組織。其中最常用的

2、生物樣品是血液和尿液。1.血樣的采集供測(cè)定的血樣應(yīng)能代表整個(gè)血藥濃度。若能從動(dòng)脈或心臟取血最為理想，但只能用于動(dòng)物，不能用于人。動(dòng)物采血可根據(jù)不同種類及實(shí)驗(yàn)需要，采取適當(dāng)?shù)姆椒?。如大、小鼠可由尾?dòng)脈、靜脈、心臟、眼眶取血或斷頭取血等，家兔可由耳緣靜脈、頸靜脈等多處取血，犬可由前、后肢靜脈等處取血。對(duì)于受試者通常采用靜脈取血(成人從肘正中靜脈取血，小兒從頸外靜脈取血)。靜脈取血一般將注射器針頭插入靜脈血管抽取。抽取的血液轉(zhuǎn)移至試管或其它容

3、器時(shí)應(yīng)緩緩壓出，以防血細(xì)胞破裂。全血在加肝素或檸檬酸、草酸鹽等抗凝劑后，離心分取血漿，其體積約為全血的一半。血清則是由血液中纖維蛋白原等影響下，引起血塊凝結(jié)而析出，離心取用，而血塊凝結(jié)時(shí)往往易造成藥物吸附的損失。全血直接作為樣品時(shí)，也應(yīng)加入抗凝劑混勻，防止凝血。對(duì)大多數(shù)藥物來(lái)說(shuō)，血漿濃度與紅細(xì)胞中的濃度呈正比，所以測(cè)定全血不能比測(cè)定血漿提供更多的信息。而全血的凈化較血漿與血清復(fù)雜，尤其是溶血后，血色素等可能會(huì)給HPLC測(cè)定帶來(lái)影響。但是

4、，一些藥物可與紅細(xì)胞結(jié)合，或藥物在血漿和紅細(xì)胞的分布比率因人而異，在這些情況下，宜采用全血。血樣抽取量受到一定的限制。人體藥代動(dòng)力學(xué)研究需要在多個(gè)時(shí)間點(diǎn)(一般為12~20點(diǎn))取樣，每次由前臂靜脈取血3~5m1。隨著高靈敏度測(cè)定方法的建立，取樣量可繼續(xù)降低，從而更易為受試者接受。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物取血量應(yīng)注意是否超過(guò)了動(dòng)物的生理承受能力。制備血漿樣品時(shí)，將采取的血樣置含有抗凝劑的試管中，緩緩轉(zhuǎn)動(dòng)試管使其充分混合、離心，所得上清液即為血漿。常用的抗凝

5、劑有肝素，它是體內(nèi)正常的生理成分，因而不會(huì)7510mg檸檬酸結(jié)晶放在舌尖上，或者將10%的檸檬酸溶液噴在舌上，棄去開(kāi)始時(shí)的唾液后再取樣)刺激，使在短時(shí)間內(nèi)得到大量的唾液，但這樣可能影響唾液中的藥物濃度。唾液中的粘蛋白決定了唾液的粘度，它是在唾液分泌后受唾液中的酶催化而生成的。為阻止粘蛋白的生成，應(yīng)將唾液在4℃以下保存。如果分析時(shí)沒(méi)有影響，則可用堿處理唾液，使粘蛋白溶解而降低粘度。唾液在保存過(guò)程中，會(huì)放出CO2，而使pH升高，需要測(cè)定唾液

6、pH時(shí)，應(yīng)在取樣時(shí)測(cè)定較好。冷凍保存的唾液解凍后應(yīng)將樣品混勻后使用，以免產(chǎn)生誤差。需要指出的是只有知道唾液中藥物濃度與血清中藥物的總濃度有一定的比值時(shí)，唾液中藥物濃度的監(jiān)測(cè)才有意義。4.糞樣的采集新鮮糞便收集之后應(yīng)立即冷凍處理。因糞便內(nèi)含有大量蛋白質(zhì)，且微量藥物包含在大量固體食物殘?jiān)?，?duì)藥物的分離和測(cè)定都帶來(lái)麻煩。因此，必須采取蛋白變性處理及藥物分離、純化等措施。二、生物樣品的儲(chǔ)存由于實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的要求，如藥代動(dòng)力學(xué)研究，在一定的時(shí)間內(nèi)必

7、須采集大量的樣品，受分析速度的限制，往往不能做到邊采樣邊分析，需將部分樣品適當(dāng)儲(chǔ)存。冷凍保存是最常用的方法。冷凍既可以終止樣品中酶的活性，又可以儲(chǔ)存樣品。在某些情況下若收集的樣品來(lái)不及冷凍處理，可先將其置冰屑中，然后再行冷凍儲(chǔ)存。冷凍時(shí)，若使用玻璃容器儲(chǔ)存樣品，需注意防止溫度驟降使容器破裂，造成樣品損失或污染。而塑料容器常含有高沸點(diǎn)的增塑劑，可能釋放到樣品中造成污染，而且還會(huì)吸留某些藥物，引起分析誤差。某些藥物特別是堿性藥物還會(huì)被玻璃容

8、器表面吸附，影響樣品中藥物的定量回收，因此，必要時(shí)應(yīng)將玻璃容器進(jìn)行硅烷化處理。為防止含酶樣品中被測(cè)組分進(jìn)一步代謝，采樣后必須立即終止酶的活性。常采用的方法有：液氮中快速冷凍、微波照射、勻漿及沉淀、加入酶活性阻斷劑(通常加入氟化鈉)等。另外，某些生物樣品中的藥物易被空氣氧化，如兒茶酚類中的阿樸嗎啡，具有鄰苯二酚結(jié)構(gòu)，易被空氣氧化產(chǎn)生醌類雜質(zhì)，若收集的血漿樣品不加抗氧劑直接在–l5℃冷藏，僅能穩(wěn)定4周，但加入抗壞血酸后，則可穩(wěn)定10周。又如