要求的艾滋病檢測實驗室中進行

1、第十單元免疫缺陷性疾病的免疫學檢測,實驗一 HIV抗體初篩實驗,獲得性免疫缺陷綜合征,是由人類免疫缺陷病毒（HIV）感染所引起的以CD4+ T細胞減少為主要特征，同時伴反復機會感染、惡性腫瘤及中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變的一組綜合征。,HIV感染的免疫學檢驗方法主要針對病毒抗原和抗病毒抗體的檢測以及免疫細胞數(shù)量和功能的分析。HIV抗體初篩實驗主要包括酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）、化學發(fā)光或免疫熒光試驗、快速檢測試驗（明膠顆粒凝集試

2、驗、免疫滲濾試驗和免疫層析試驗）等。ELISA是最常用的HIV抗體初篩實驗方法。本實驗采用雙抗原夾心ELISA法檢測人血清中HIV抗體。,檢測方法,在符合Ⅱ級生物安全實驗室（BSL-2）要求的艾滋病檢測實驗室中進行。,實驗條件,將HIV抗原包被于固相載體，加入待檢樣品和酶標記的HIV抗原，形成抗原－抗體－酶標抗原復合物，洗滌，加底物顯色。通過酶標儀檢測吸光度A450nm 值，根據(jù)A450nm 值判斷HIV抗體的存在與否。,實驗原理,

3、1.HIV抗原酶標板。2.洗滌液 PBS-Tween20。 3.辣根過氧化物酶標記的HIV抗原。4.辣根過氧化物酶底物溶液。5.底物稀釋液 PBS-1%BSA。6.終止液 2mol/l H2SO4溶液。7.對照血清 臨床標本篩選獲得的陽性血清和陰性血清。8.酶標儀、洗板機。,試劑與器材,操作步驟,編號：將樣品對應微孔按序編號，每板設陰性對照2孔、 陽性對照3孔，空白對照2孔

4、加樣：分別在相應孔加入待檢標本、陰性、陽性對照 100μl，用封板膜封板后置37℃溫育60min。洗滌：用洗板機清洗，在干凈濾紙上拍干。加酶：每孔加酶結(jié)合物100μl（空白對照孔除外），充分 混勻，置37℃溫育30min。洗滌：用洗板機清洗，在干凈濾紙上拍干。顯色：每孔加入底物緩沖液50μl，TMB 50μl，振蕩混 勻，37℃避光顯色10min。 測定：

5、每孔加終止液50μl，振蕩混勻。在450nm波長 下，酶標儀測定各孔A450nm值。,結(jié)果判斷,計算臨界值：臨界值=陽性對照值×10%。正常情況下，陽性對照孔的A450nm值≥0.80，樣品A450nm值≥臨界值者為HIV抗體陽性。正常情況下，陰性對照孔的A450nm值≤0.08，樣品A450nm值＜臨界值者為HIV抗體陰性。,注意事項,實驗中設立陽性與陰性對照。底物顯色時間不宜過長。注

6、意生物安全。對初篩呈陽性反應的樣品，應進行復檢試驗。如復檢均呈陰性，則報告HIV抗體陰性（-）；如均呈陽性反應，或一陰一陽，應送HIV確證實驗室進行確證試驗。,臨床意義,作為HIV感染的篩查實驗。HIV有兩個血清型：HIV-1和HIV-2，后者少見。此試驗陽性者應進一步作確證試驗。,思考題,ELISA是檢測HIV抗體的常用方法，但并不是唯一的方法?；瘜W發(fā)光或免疫熒光試驗、免疫膠體金以及免疫層析實驗等均可用于HIV抗體的檢測，試比較各

7、種方法之間的優(yōu)缺點。,第三軍醫(yī)大學 吳超,實驗二 HIV確認實驗,HIV抗體初篩試驗陽性者，須作確證試驗。確證實驗必須在專門的艾滋病確證實驗室中進行，并最終確定患者是否感染HIV。確證試驗方法包括免疫印跡試驗、條帶免疫試驗、放射免疫沉淀試驗、免疫熒光試驗等。免疫印跡實驗(Western Blot，WB)是用以檢測HIV抗體的首選確證試驗方法，其檢測結(jié)果常常被作為鑒別其他檢驗方法優(yōu)劣的“金標準”。,以硝酸纖維素膜為

8、載體的抗原條，組合了HIV-1全病毒抗原和HIV-2 gp36重組蛋白抗原。當抗原條與被檢血清及對照血清接觸時，如血清標本有HIV-1/HIV-2特異性抗體，將會與抗原條上的HIV-1/HIV-2 gp36抗原結(jié)合。結(jié)合的抗體再與酶標二抗結(jié)合，加入底物顯色，觀察結(jié)果判斷。,實驗原理,1.HIV1/2抗原硝酸纖維膜條          

9、60;  20條2.印跡緩沖液（10×）                     12ml3.漂洗緩沖液（10×）       

10、;              60ml4.底物BCIP/NBT溶液                    &

11、#160;   50ml5.結(jié)合物                               

12、0;              70μl6.HIV1/2陰性對照血清                       70

13、μl7.HIV1弱陽性對照血清                   70μl8.HIV1強陽性對照血清            

14、60;      70μl9.反應槽、搖床、移液管、吸引器,試劑與器材,操作步驟,取出反應槽，每一槽內(nèi)加2ml漂洗緩沖液。用鑷子小心地夾住抗原條編號端放入漂洗緩沖液中，編號面朝上，每槽1條，讓溶液完全覆蓋。將反應槽放置搖床，搖動5～10分鐘后吸棄漂洗液。每槽加入印跡緩沖液2ml，然后分別加入20μl待檢血清或血漿，并用本試劑盒中的對照血清作平行對照。在室溫下將反應槽

15、在搖床上搖動60分鐘。旋搖完畢后，吸棄印跡緩沖液。,每槽加入2ml漂洗緩沖液，旋搖5分鐘后，吸棄漂洗緩沖液，共漂洗3次，每次5分鐘。在每槽中加入2ml結(jié)合物稀釋液，旋搖45分鐘。從槽中吸棄結(jié)合物稀釋液，重復步驟6。每槽中加入底物2ml，旋搖15分鐘。吸去底物液，每槽中加入2ml蒸餾水，旋搖5分鐘 后，終止反應。將抗原條放于二張濾紙間吸干水分后觀察結(jié)果。,結(jié)果判斷,1. 對照血清檢測結(jié)果判定要求① H

16、IV-1強陽性對照血清：必需出現(xiàn)gp160/gp120和gp41、p24帶型，以及p66、p55/p51、p34、p17帶型判定為陽性，HIV-2 gp36應為陰性。② HIV-1弱陽性對照血清：在gp160、gp120和gp41、p24帶型中至少出現(xiàn)二條，判定為陽性。其他位置其可能出現(xiàn)弱帶，但對分析并非必需。HIV-2 gp36應為陰性。③ HIV-2陽性對照血清：必需出現(xiàn)gp36重組蛋白帶型。④ 陰性對照血清：應無上述的

17、特異性帶型出現(xiàn)。,2. 被檢血清/血漿的判定標準有下列情況之一者判定為HIV-1抗體陽性。 ①至少一條env帶和一條pol帶； ②至少一條env帶和一條gag帶； ③至少一條env帶、一條gag帶和一條pol帶； ④至少二條env帶；有HIV-2 gp36重組蛋白帶型出現(xiàn)者判定為HIV-2抗體陽性，需用HIV－2確認試劑進一步檢測。無HIV抗體特異性帶型出現(xiàn)者判定為HIV抗體陰性。出現(xiàn)HI

18、V特異性抗體帶型，但帶型不足以確認陽性者，判定為HIV抗體可疑。,注意事項,實驗中必須同時設定HIV-1強陽性、HIV-1弱陽性和HIV-1+2陰性血清對照。如果抗原條和血清樣品作用時間過長，陰性樣品也可能出現(xiàn)弱帶。凡溶血、脂血或混濁樣品均為不宜檢測標本。試驗中操作應注意生物安全。底物顯色時間，一般控制在30分鐘內(nèi)。時間太長，本底變深；如果強陽性血清色帶增深時可提前終止反應；若弱陽性對照血清色帶較淺，可以適當延長反應時間。,臨床

19、意義,用于在初篩試劑判斷為HIV陽性(如ELISA法)基礎上的血清或血漿樣本，進行確證是否為HIV-1陽性及診斷是否感染了HIV-2。,思考題,HIV血清抗體檢測的初篩實驗和確認實驗在檢測HIV感染的臨床意義及實驗原理上的差異？免疫印記實驗、條帶免疫試驗、放射免疫沉淀試驗及免疫熒光試驗（IFA）等均可用作HIV的確認實驗，試分析免疫印記實驗應用如此廣泛的原因 ?,第三軍醫(yī)大學 吳超,實驗三 T細胞亞群的流式細胞儀

20、檢測,HIV感染可導致免疫系統(tǒng)中CD4+T細胞數(shù)量減少以及CD4+ T細胞/CD8+ T細胞比例失調(diào)，因此，CD4+T細胞計數(shù)可用于評價HIV感染者免疫狀況，輔助臨床進行疾病分期。 CD4+T淋巴細胞數(shù)量還可評估HIV感染者機會性感染的風險，輔助判斷是否進行預防性治療。,背景知識,CD4+和CD8+T淋巴細胞計數(shù)的方法分為兩大類，一類是應用流式細胞儀測定法，另一類是非流式細胞儀測定法。其中，流式細胞儀檢測是目前應用較

21、為普遍的一種方法，包括多平臺法和單平臺法。 單平臺法僅需要流式細胞儀進行群體細胞的相對計數(shù)。本實驗主要介紹單平臺法對T淋巴細胞的流式細胞檢測。,流式細胞儀可檢測單細胞或微粒的信號，將待測細胞或微粒進行熒光染色后制成懸液標本，在一定氣體壓力下將待測樣品壓入流動室，待測細胞在鞘液的包裹下單行排列，依次通過流式細胞儀的檢測區(qū)域。單平臺方法即應用三色、四色流式試劑配以內(nèi)參絕對計數(shù)微球，加上流式細胞儀淋巴細胞亞群獲取和分析軟件，一

22、步即可獲得T細胞亞群的相對數(shù)（百分比）和絕對數(shù)。通過使用已知數(shù)量的參考微球為內(nèi)參，可通過獲取的目標細胞與參考微球的比例、參考微球數(shù)量和樣品體積，得到每微升的淋巴細胞數(shù)量。,實驗原理,,,TruCOUNT絕對計數(shù)管。TriTEST三色試劑CD4-FITC/CD8-PE/CD3-PerCP或MultiTEST四色試劑CD3-FITC/CD8-PE/CD45-PerCP/CD4-APC。FACS Lysing Solution（10X）

23、 蒸餾水（0.45μm過濾）配制成1X濃度的溶血素；PBS鞘液 0.45μm過濾；BD CaliBRITE Beads及BD TruCOUNT controls。流式細胞儀。,試劑與器材,操作步驟,1.標本制備：采集外周靜脈血2-3ml,EDTA-K3抗凝。標本 與試劑用前輕輕搖勻；2.準確加入20μl熒光試劑和50μl全血，充分混勻；3.充分混勻，室溫（20～25℃）避光反應15min；4.加入450

24、μl FACS溶血液 (1X)，充分混勻；5.充分混勻，室溫（20～25 ℃ ）避光放置15min； 6.24h內(nèi)流式檢測。,單平臺一步法由計算機軟件直接出結(jié)果并打印出報告單，報告單的內(nèi)容包括如下：,結(jié)果判斷,注意事項,用于流式細胞儀免疫表型檢測的抗凝劑 K2EDTA、K3EDTA、酸性枸櫞酸葡萄糖溶液（ACD）或肝素抗凝一般要求48h內(nèi)染色，染色后6h內(nèi)分析。如采血后24h內(nèi)染色，則可在染色后24h內(nèi)分析。在室溫（18～

25、25℃）保存和運輸樣品，避免極端溫度（結(jié)冰或大于37℃）。高溫季節(jié)，需用隔熱容器盛裝樣品，并將其置于有冰袋和吸熱物質(zhì)的容器中。溶血、凝血或結(jié)冰的樣品應視為不合格樣品，超過檢測允許時間的樣品不可檢測。應報告所有相關數(shù)據(jù)的正常值范圍，且每個實驗室都應測定參考數(shù)值。,臨床意義,①用于HIV感染者的疾病分期： 凡CD4+T淋巴細胞＜200/μl或CD4+T淋巴細胞的百分比＜14%的HIV感染者可歸入艾滋病。②判斷HIV感染的臨床合并癥：

26、如CD4+T淋巴細胞＜200/μl時，易發(fā)生卡氏肺囊蟲肺炎；而巨細胞病毒感染和鳥分支桿菌感染常發(fā)生于CD4+T淋巴細胞＜50/μl的病人，極少見于CD4+T淋巴細胞＞100/μl的病人。,思考題,T淋巴細胞的流式細胞檢測技術(shù)包括多平臺法和單平臺法，試述兩種方法的差異？,第三軍醫(yī)大學 吳 超,臨床見習： HIV抗體初篩試驗,了解HIV抗體初篩試驗的實驗室要求和檢測流程與質(zhì)量控制，熟悉用于HIV抗體初篩試驗的樣品種類與采集要求

27、，掌握HIV抗體初篩試驗中ELISA檢測方法原理與結(jié)果分析。,見習要點,采用雙抗原夾心ELISA法檢測血清中HIV（1+2）抗體。HIV抗原包被于固相載體，加入待檢樣品和酶標記的HIV抗原，形成抗原－抗體－酶標抗原復合物，洗滌，加底物顯色。通過酶標儀檢測吸光度（OD值），根據(jù)OD值判斷HIV抗體的存在與否。,基本原理,樣品的采集與要求,HIV抗體初篩試驗可采用血清、血漿樣品。,1．采樣前準備 根據(jù)檢測項目的具體要求，確

28、定采集樣品的種類、處理、保存及運輸?shù)臅r限和方法，按照臨床采血技術(shù)規(guī)范的要求操作，遵守生物安全要求。 檢查所需物品是否已備齊，是否在有效期內(nèi)，有無破損，是否足量，特別應檢查受檢者信息與樣品容器表面的標記是否一致，并注明樣品采集時間。選擇合適的室內(nèi)（外）采血空間，受檢者坐（臥）于合適的位置，準備采血用具、皮膚消毒用品、采血管及試管架、硬質(zhì)廢棄物容器等。,2．采集和處理樣品①血漿：將采集的抗凝全血1500～3000r/mi

29、n離心15min，上層即為血漿，吸出置于合適的容器中，備用。②血清：根據(jù)需要，用一次性注射器（或真空采血管）抽取5～10ml靜脈血，室溫下自然放置1～2h，待血液凝固、血塊收縮后再用1500～3000r/min離心15min，吸出血清，置于合適的容器中，備用。,3．樣品的保存 用于HIV抗體檢測的血清或血漿樣品，短期（1周）內(nèi)進行檢測的可存放于2～8℃， 一周以上應存放于-20℃以下。艾滋病檢測篩查實驗室檢測的篩查

30、陽性樣品應及時送確證實驗室，而篩查陰性樣品，可根據(jù)具體需要決定保存時間，建議至少保存1～2個月。特殊用途或?qū)ｍ楉椖康臉悠犯鶕?jù)具體要求確定保存時間。,4．樣品的運送 根據(jù)符合生物安全要求；要獲得相應部門批準并由具有資質(zhì)的人員專程護送。應采用三層容器對樣品進行包裝，隨樣品應附有與樣品唯一性編碼相對應的送檢單。送檢單應標明受檢者姓名、樣品種類等信息，并應放置在第二層和第三層容器之間。,1．初篩試驗 根據(jù)檢測

31、目的選用符合要求的篩查試劑對樣品進行初篩檢測，對呈陰性反應的樣品，可出具HIV抗體陰性（-）報告；對呈陽性反應的樣品，需要進一步做復檢試驗和確證試驗。,篩查程序,2．復檢試驗 對初篩呈陽性反應的樣品，應使用原有試劑和另外一種不同原理（或廠家）的試劑，或另外兩種不同原理或不同廠家的試劑進行復檢試驗。如果初篩檢測使用抗原抗體聯(lián)合試劑，則復檢必須包括一種抗原抗體聯(lián)合試劑。如兩種試劑復檢均呈陰性反應，則報告HIV抗體陰性（-）

32、；如均呈陽性反應，或一陰一陽，需送艾滋病確證實驗室進行確證試驗（圖圖 HIV抗體篩查檢測流程）。如果抗原抗體聯(lián)合試劑檢測呈陽性反應，而抗體試劑檢測為陰性反應，則應考慮進行HIV-1 p24抗原或核酸檢測，必要時進行隨訪。 艾滋病檢測篩查實驗室復檢判定為陽性反應的樣品，確證實驗室可以直接進行確證試驗。,3. 初篩和復檢流程,,圖 HIV抗體篩查檢測流程,4．篩查試驗結(jié)果的報告 HIV抗體篩查試驗用附

33、表1 （見實驗指導教材）進行報告，陰性反應報告為“HIV抗體陰性（-）”；陽性反應報告為“HIV抗體待復檢”。,5．篩查試驗呈陽性反應樣品的轉(zhuǎn)送 如需送上級實驗室進行復檢，需要核對身份，補充個人信息（如姓名和身份證號碼），必要時采集第二份血樣，持HIV抗體篩查報告，送當?shù)匕滩『Y查中心實驗室，或直接送確證實驗室復檢。HIV抗體復檢試驗用附表2（見實驗指導教材） 進行報告，兩次檢測均陽性或一陰一陽報告為 “HIV抗體待確

34、證”；兩次檢測均陰性報告為“HIV抗體陰性（-）”。HIV抗體復檢報告需由1名檢驗人員和1名審核人員簽字。,質(zhì)量控制,1．試劑盒內(nèi)部對照 試劑盒內(nèi)部對照質(zhì)控品即為試劑盒內(nèi)提供的陽性和陰性對照血清。試劑盒內(nèi)部對照用于判斷每次實驗的有效性，但不能作為室內(nèi)質(zhì)控品使用。每一次檢測臨床樣品時，必須有試劑盒內(nèi)部對照，而且只能在同批號的試劑盒中使用。內(nèi)部對照結(jié)果無效，必須重新試驗。,2．室內(nèi)質(zhì)控品 為非試劑盒組份

35、的外部質(zhì)控品，是為了監(jiān)控檢測的重復性而設置的，包括強陽性、弱陽性和陰性質(zhì)控血清。也可以只設置一個弱陽性質(zhì)控，以該試劑盒臨界值（Cut-off）的2～3倍為宜。外部質(zhì)控品的作用是，判斷該批臨床樣品檢測的有效性，因此，每次實驗必須包含室內(nèi)質(zhì)控品，其結(jié)果無效，必須重新試驗。室內(nèi)質(zhì)控品可以是商品或?qū)嶒炇易孕兄苽洹?3．建立質(zhì)控圖 最常用的質(zhì)控圖是Levey-Jennings質(zhì)控圖，該圖使用累計和技術(shù)或趨勢分析技術(shù)的圖形提供系統(tǒng)

36、偏移和漂移的狀況。,（1）建立質(zhì)控圖參數(shù)：外部質(zhì)控品的均值和標準差應建立 在實驗室常規(guī)使用方法對外部質(zhì)控品重復測定的基礎 上。一般采用在不同批次檢測取得至少20個數(shù)據(jù)；如 果僅做少量批次的檢測，也至少做5個批次的檢測，每 個批次中不少于4個質(zhì)控血清測定結(jié)果，以建立一個臨 時性的均值和標準差，當達到20批次數(shù)據(jù)后，替代臨 時性的均值

37、和標準差。 （2）繪制質(zhì)控圖：質(zhì)控圖是把檢測數(shù)據(jù)與已確定的（計算 出的）“控制限”進行比較的圖，包含一條中心橫線和 其上、下兩條平行的控制線，并按時間順序點入本實 驗室每批次試驗質(zhì)控血清的測定值。,（3）質(zhì)控規(guī)則及其使用:實驗室在報告實驗結(jié)果之前必須評 價質(zhì)控數(shù)據(jù)，可通過圖形記錄的檢查或由計算機審核 結(jié)果來決定。目前有許多質(zhì)控規(guī)則，常用的是

38、12S和 13S規(guī)則。①告警（12S）：當外部質(zhì)控品的S/CO值超出 +2s范圍時，系統(tǒng)處于告警狀態(tài)，應予注意，是否可以繼續(xù)檢測需要進一步觀察。若將12S做失控標準，有較高的假失控概率，所以一般不采用。②失控（13S）：當外部質(zhì)控品的S/CO值超出 +3s范圍時，系統(tǒng)處于失控狀態(tài)，本次實驗結(jié)果不能被接受，可能是系統(tǒng)誤差、隨機誤差或外部質(zhì)控品 穩(wěn)定性下降所致。③ 漂移：連續(xù)幾次（3～5次）外部質(zhì)控品的S/CO值

39、都落在均值的一側(cè)則稱為漂移，提示實驗條件發(fā)生了較大的變化。④趨勢：連續(xù)幾次（5～7次）外部質(zhì)控品的S/CO值幾乎按一個方向分布時稱為趨勢，通常由參數(shù)的緩慢改變引起。,（4）質(zhì)控圖的分析及失控處理：實驗室應建立質(zhì)控圖分析及失控情況處理程序。當質(zhì)控已有計劃并恰當?shù)貓?zhí)行時，要求可靠的均值和標準差用于計算質(zhì)控限，將假失控概率降到最低。當出現(xiàn)失控時，對原有外部質(zhì)控品重復測定或更換新的外部質(zhì)控品進行測定不是最有效的方法，必須找出問題發(fā)生的原因，找

40、出解除問題的方法，并消除原因，防止將來出現(xiàn)同樣的問題。,4．室內(nèi)質(zhì)控其他方式— “即刻法”質(zhì)控,“即刻法”質(zhì)控方法是在對同一批外部質(zhì)控血清連續(xù)測定3次后，即可對第3次檢驗結(jié)果進行質(zhì)控。具體計算方法如下：,,（1）將質(zhì)控血清的測定值從小到大排列：x1、x2、x3……xn（x1為最小值，xn為最大值）。（2）計算 和s。（3）計算SI上限值 和SI下限值。,（4）將SI上限、SI下限與SI值表中的數(shù)字比較。,① 當SI上限和SI下