流式細(xì)胞儀原理及應(yīng)用hiv

1、碧迪醫(yī)療器械（上海）有限公司上海市靜安嘉里中心3座10樓李蘇輝,流式細(xì)胞儀原理及儀器維護(hù)保養(yǎng),,白細(xì)胞的組成,,,,,,,,白細(xì)胞的組成及其分化抗原白細(xì)胞在分化成熟過(guò)程中，不同的發(fā)育階段和不同亞類(lèi)的白細(xì)胞出現(xiàn)或消失的表面標(biāo)記，這是區(qū)分白細(xì)胞的重要標(biāo)志。1986年世界衛(wèi)生組織命名委員會(huì)建議應(yīng)用CD系列來(lái)統(tǒng)一命名白細(xì)胞分化抗原,SHA- LFR032-20080930-4N 13E for Jerel,細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞;分泌穿孔素

2、、IFN、、TNF等。特點(diǎn)：MHC-1類(lèi)分子限制、直接接觸、反復(fù)殺傷,自然殺傷細(xì)胞（NK)：抗體依賴(lài)細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用、淋巴因子介導(dǎo)細(xì)胞毒作用、,抗體依賴(lài)的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用,補(bǔ)體系統(tǒng)的活化（經(jīng)典、凝集素、替代途徑）。作用（溶胞作用、吞噬條理作用、趨化性、 炎癥反應(yīng)等）,中和抗原：形成免疫復(fù)合物，被吞噬細(xì)胞清除（條理作用）、毒素中和作用、感染中和作用,體液免疫和細(xì)胞免疫的作用,淋巴因子依賴(lài)的細(xì)胞毒作用,免疫應(yīng)答的過(guò)程及Th細(xì)胞

3、的作用,免疫應(yīng)答：細(xì)胞免疫體液免疫Th細(xì)胞作用：Th1分泌IL-2、INF等，前者可誘導(dǎo)Th、Tc分裂增值； Th2分泌IL-4、IL-5,可使B細(xì)胞活化，產(chǎn)生抗體B細(xì)胞完全活化需要Th幫助,,,,,,,流式細(xì)胞儀原理,流式細(xì)胞術(shù)(Flow cytometry)對(duì)于處在流動(dòng)狀態(tài)的細(xì)胞或生物顆粒同時(shí)進(jìn)行多參數(shù)的快速的分析和定量的技術(shù),BD公司HIV領(lǐng)域流式細(xì)胞儀產(chǎn)品,FACSCount流式細(xì)胞儀,FACSCalibur流式

4、細(xì)胞儀,,T,T,C,H,,,CD3,CD3,,,,,,CD8,CD4,,,,,,,流式細(xì)胞儀檢測(cè)原理及在T細(xì)胞分析中應(yīng)用,,,,,,,,,,,,,Analyze,,,,,,,,,,,,,激發(fā)光源與熒光標(biāo)記物,FACSCalibur流式細(xì)胞儀儀器結(jié)構(gòu),液流系統(tǒng)光學(xué)系統(tǒng)激光光源光收集系統(tǒng)電子系統(tǒng)光電轉(zhuǎn)換數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)軟件系統(tǒng),液流系統(tǒng)-鞘液,流式細(xì)胞儀原理,,,光學(xué)系統(tǒng),激光 (Laser, light amplificat

5、ion by stimulated emission of radiation)是一種相干光源，它能提供單一波長(zhǎng)、高強(qiáng)度及穩(wěn)定性高的光照激光波長(zhǎng): 488nm, 635nm,,檢測(cè)信號(hào),散射光信號(hào)FSC: 前向角散射光SSC: 側(cè)向角散射光(90度散射光) 熒光信號(hào)熒光染料光學(xué)濾片,,檢測(cè)信號(hào),前向角散射光信號(hào),,前向角散射光信號(hào),散射光信號(hào)—前向角散射光信號(hào)(FSC),FSC----Forw

6、ard (Angel Light) Scatter在激光束正前方的檢測(cè)器, 為前向散射光檢測(cè)器 FSC的強(qiáng)度與細(xì)胞或其他顆粒的大小, 形狀及 optical homogeneity 有關(guān)FSC用于檢測(cè)細(xì)胞或其他粒子的表面屬性如:大小,,,,側(cè)向角散射光信號(hào),,側(cè)向角散射光信號(hào),側(cè)向角散射光信號(hào)(SSC),SSC-Side (Angel Light) Scatter 與激光束垂直方向的檢測(cè)器為側(cè)向檢測(cè)器, 也稱(chēng)為90

7、度散射光檢測(cè)器 SSC的強(qiáng)度與細(xì)胞或其他顆粒的大小, 形狀及 optical homogeneity 有關(guān)SSC用于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)如:胞漿內(nèi)顆粒多少, 核質(zhì)比,,,,流式細(xì)胞儀的檢測(cè)信號(hào)：散射光,FSC，前向角散射光，代表細(xì)胞大小SSC，側(cè)向角散射光，代表細(xì)胞粒度,Right Angle Light Detector ? Cell ComplexitySSC,Forward Light Detector ? Cel

8、l Surface Area FSC,Incident Light Source,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,熒光信號(hào),每種熒光染料均有特定的激發(fā)波長(zhǎng), 并激發(fā)后會(huì)有發(fā)射波長(zhǎng),流式細(xì)胞儀檢測(cè)的即是它特定的發(fā)射波長(zhǎng). 利用各種不同波長(zhǎng)的光學(xué)濾片來(lái)收集(檢測(cè))這些光學(xué)信號(hào),,,,光學(xué)系統(tǒng),FCM的光學(xué)系統(tǒng)是由若干組透鏡, 濾波片, 小孔組成,光路 - 濾片

9、特性,長(zhǎng)通濾片 – 允許長(zhǎng)于設(shè)定波長(zhǎng)的光通過(guò) 短通濾片 – 允許短于設(shè)定波長(zhǎng)的光通過(guò) 帶通濾片 – 允許一定帶寬的波長(zhǎng)通過(guò),,,,,,,460 500 540,460 500 540,460 500 540,,,,,,,,,,,,,,,,,,,SP 500,,,,LP 500,,,,BP500/50,長(zhǎng)通 短通

10、 帶通,,,,光學(xué)濾片,熒光信號(hào),熒光信號(hào),光路 - 濾片特性,當(dāng)以 45o 角放置長(zhǎng)通濾片時(shí),該濾片可以通過(guò)一定波長(zhǎng)的光,同時(shí)也可以阻斷并折射該波長(zhǎng)以下的光 這種方式的濾片稱(chēng)為二向色性長(zhǎng)通濾片( dichroic filter),,,光學(xué)系統(tǒng),電子系統(tǒng),當(dāng)細(xì)胞攜帶熒光素標(biāo)記物, 通過(guò)激光照射區(qū)時(shí), 受激激發(fā), 產(chǎn)生代表細(xì)胞內(nèi)不同物質(zhì)、不同波長(zhǎng)的熒光信號(hào), 這些信號(hào)經(jīng)A/D轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號(hào), 送計(jì)

11、算機(jī)進(jìn)行儲(chǔ)存、 作圖、 統(tǒng)計(jì)分析,發(fā)射波長(zhǎng),,Wavelength (nm),400,450,500,550,600,650,700,1000,800,600,400,200,0,PE,FITC,PerCP,,,,,,750,流式細(xì)胞儀原理,熒光信號(hào),,,,,,650nm,700nm,,,,500nm,600nm,,,,,,,Relative Intensity,Wavelength (nm),550nm,檢測(cè)器,Photomultip

12、lier tube (PMT) 將光學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)殡娒}沖(數(shù)字?jǐn)?shù)據(jù))信號(hào),,,,,,單平臺(tái)絕對(duì)計(jì)數(shù),管中預(yù)先加有準(zhǔn)確定量的Beads流式細(xì)胞儀獲取數(shù)據(jù)后，由各目標(biāo)群的含量，可以計(jì)算出相對(duì)含量%由各目標(biāo)群與Beads的相對(duì)量計(jì)算，得到該細(xì)胞群的絕對(duì)含量計(jì)算公式： 細(xì)胞獲取數(shù)Beads總量細(xì)胞/?L= ?????? ? ?????? Beads獲取數(shù) 樣本量注：Beads總量見(jiàn)

13、TruCOUNT管外包裝MultiSET系統(tǒng)中，樣本量為50 ?L,單平臺(tái)絕對(duì)計(jì)數(shù),使用TriTEST或MultiTEST試劑，在TruCOUNT管中完成全血的淋巴細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)TruCOUNT管中預(yù)先加有準(zhǔn)確定量的Beads，每批TruCOUNT管的Beads含量一致由各目標(biāo)群與Beads的相對(duì)量計(jì)算，得到該細(xì)胞群的絕對(duì)含量使用直接熒光標(biāo)記抗體組合，一步處理外周血使用免洗技術(shù)，溶血后直接上機(jī)檢測(cè)標(biāo)本操作簡(jiǎn)便，省時(shí)省力，

14、計(jì)數(shù)結(jié)果重復(fù)性好,淋巴細(xì)胞分析,使用特異的單克隆抗體，進(jìn)行多色分析，同時(shí)分析淋巴細(xì)胞上多種抗原的表達(dá)，可以將淋巴細(xì)胞亞群區(qū)分開(kāi)，進(jìn)行定量分析淋巴細(xì)胞分析TriTEST：三色試劑CD4/CD8/CD3，CD3/CD4/CD45MultiTEST ：四色試劑CD3/CD8/CD45/CD4TruCOUNT：?jiǎn)纹脚_(tái)絕對(duì)計(jì)數(shù)管報(bào)告Th,Ts,Th/Ts百分含量%與絕對(duì)含量cells/uL,TriTEST CD4/CD8/CD3,T

15、Lymph EventsCD3+CD4+ %T LymphCD3+CD8+ %T LymphCD3+ CD4+CD8+%T LymphT H/S Ratio,Bead EventsCD3+ Abs CntCD3+CD4+ Abs CntCD3+CD8+ Abs CntCD3+CD4+CD8+ Abs Cnt,淋巴細(xì)胞四色分析,Lymph Abs CntCD3+ % LymphCD3+ Abs CntCD3+CD4

16、+%Lymph CD3+CD4+ Abs CntCD3+CD8+%Lymph CD3+CD8+ Abs CntCD3+CD4+CD8+%LymphCD3+CD4+CD8+ Abs CntT H/S Ratio,MultiTEST CD3/CD8/CD45/CD4,MultiTEST CD3/CD15+56/CD45/CD19,FacsCalibur儀器樣本操作,儀器校正：加入校正試劑內(nèi)的液體必須和鞘液桶的一樣。樣本操作：溶血、

17、有凝塊的血不要做 加樣前，抗凝血顛倒混勻8－10次（避免混勻器混勻） 使用反向加樣法，槍頭貼壁。加樣槍在試管內(nèi)不要放松,,FACSComp沒(méi)有通過(guò)怎么辦？,FSC或SSC沒(méi)有通過(guò)：原因：1.由于儀器的管路沒(méi)有清洗干凈2.使用的鞘液雜質(zhì)太多(換鞘液）BD公司專(zhuān)用鞘液3.校準(zhǔn)品失效4.儀器故障措施：1. 用蒸餾水高速運(yùn)行儀器10分鐘－30分鐘2. 過(guò)濾鞘液

18、3. 使用新的校準(zhǔn)品4. 致電BD工程師,FacsCalibur儀器,BD原裝鞘液：過(guò)濾、消毒。0.22um濾膜過(guò)濾鞘液桶放入3升鞘液（不要放滿(mǎn)），清除廢液桶廢液，裝200毫升漂白劑先開(kāi)儀器再開(kāi)電腦在按Prime按鈕去除流動(dòng)池氣泡時(shí)，上樣架處在偏離位置做好每日維護(hù)，建議每次關(guān)機(jī)時(shí)做FacsClean和FacsRinse清洗。（1） FacsClean，Run Hi 支架旁位2分鐘；支架正位3分鐘 （2） FacsRinse，

19、步驟同上 （3）蒸餾水， Run Hi2分鐘旁位，5分鐘正位（4）去除鞘液壓力（5）選擇Standby模式10分鐘后關(guān)機(jī) 月維護(hù)中鞘液桶裝入FacsClean (0.5％－1％的漂白劑)，旁路鞘液過(guò)濾器。每3個(gè)月－6個(gè)月清洗空氣過(guò)濾網(wǎng)（用水沖洗再晾干）。過(guò)濾器6個(gè)月更換,FACSCount,儀器性能,樣本穩(wěn)定性制備后室溫(20—25 0C)儲(chǔ)存48小時(shí)全血穩(wěn)定性采集后室溫(20—25 0C )儲(chǔ)存48小時(shí),FacsCoun

20、t樣本處理,FacsCount質(zhì)控：正常血，樣本用前顛倒混勻（避免混勻器上混勻）。反向加樣法，槍頭貼管壁,分離最后一滴。試劑在開(kāi)蓋前可以在混勻器上顛倒混勻每次更換槍頭，樣本多時(shí)，每次更換試劑對(duì)管管蓋加入固定液后30分鐘以后再操作更安全,FacsCount儀器,用水沖洗開(kāi)蓋器，用輕柔的去污劑或70％酒精清洗電子加樣槍,用1：10的漂白劑清洗Workstation避免在廢液桶里裝高濃度的漂白劑每次試驗(yàn)結(jié)束后廢液桶必須清空,然

21、后用自來(lái)水沖洗.建議關(guān)機(jī)后取出廢液桶,下次實(shí)驗(yàn)時(shí)再放置在儀器里電子加樣槍不用時(shí)需從支架上取下.軟盤(pán)復(fù)制（已做過(guò)質(zhì)控的軟盤(pán)作為母盤(pán)）連續(xù)做15個(gè)標(biāo)本需要做清洗，如果試驗(yàn)中間中斷1小時(shí)以上，需要清洗；將裝有蒸餾水的上樣管置于上樣針位置，保持上樣針濕潤(rùn)，防治結(jié)晶；關(guān)機(jī)。如果長(zhǎng)時(shí)間不做試驗(yàn)，建議每周用蒸餾水清洗,FacsCount儀器,FacsCount的每日維護(hù)；1.運(yùn)行CLEAN程序，2.上樣管放置稀釋的FacsCl

22、ean（稀釋10倍次氯酸鈉） 3分鐘3.再放置裝有FacsRinse（Tween 稀釋10倍1/00%)上樣管清洗3分鐘4.重新執(zhí)行CLEAN程序，F(xiàn)acsRinse （Tween 稀釋10倍1/00%)再洗3分鐘5.放置裝有蒸餾水的上樣管清洗3分鐘6.試驗(yàn)結(jié)束后，放置裝有蒸餾水的上樣管浸泡上樣針，避免管道結(jié)晶6.儀器無(wú)用時(shí)建議取出廢液桶,FacsCount儀器,FacsCount的長(zhǎng)沖洗；1.短路過(guò)濾器,并在鞘液桶內(nèi)和試管

23、中放置稀釋5倍的次氯酸鈉2.運(yùn)行CLEAN程序(二個(gè)循環(huán))后進(jìn)入U(xiǎn)TILITY程序，按“Shutdown”鍵，使上樣針浸泡在裝有次氯酸鈉的試管中，將儀器電源關(guān)掉，讓儀器管道浸泡30分鐘 2.倒掉鞘液桶內(nèi)的次氯酸鈉，將鞘液桶洗干凈，換上干凈的（蒸餾水或純凈水），試管中換上蒸餾水或純凈水，再運(yùn)行清洗程序一個(gè)循環(huán)，執(zhí)行排氣泡“Drain”命令兩次 3.恢復(fù)鞘液接頭和過(guò)濾器的接頭到原來(lái)位置，排除過(guò)濾器內(nèi)的空氣，再次運(yùn)行CLEAN程序（一個(gè)