液相色譜儀結(jié)構(gòu)及原理

1、液相色譜儀結(jié)構(gòu)及原理液相色譜儀結(jié)構(gòu)及原理高效液相色譜法是在經(jīng)典色譜法的基礎(chǔ)上，引用了氣相色譜的理論，在技術(shù)上，流動相改為高壓輸送（最高輸送壓力可達4.9107Pa）色譜柱是以特殊的方法用小粒徑的填料填充而成，從而使柱效大大高于經(jīng)典液相色譜（每米塔板數(shù)可達幾萬或幾十萬）；同時柱后連有高靈敏度的檢測器，可對流出物進行連續(xù)檢測。一、特點：1高壓：液相色譜法以液體為流動相（稱為載液），液體流經(jīng)色譜柱，受到阻力較大，為了迅速地通過色譜柱，必須對載

2、液施加高壓。一般可達150～350105Pa。2.高速：流動相在柱內(nèi)的流速較經(jīng)典色譜快得多，一般可達1～10mlmin。高效液相色譜法所需的分析時間較之經(jīng)典液相色譜法少得多，一般少于1h。3.高效：近來研究出許多新型固定相，使分離效率大大提高。4.高靈敏度：高效液相色譜已廣泛采用高靈敏度的檢測器，進一步提高了分析的靈敏度。如熒光檢測器靈敏度可達1011g。另外，用樣量小，一般幾個微升。5.適應(yīng)范圍寬：氣相色譜法與高效液相色譜法的比較：氣

3、相色譜法雖具有分離能力好，靈敏度高，分析速度快，操作方便等優(yōu)點，但是受技術(shù)條件的限制，沸點太高的物質(zhì)或熱穩(wěn)定性差的物質(zhì)都難于應(yīng)用氣相色譜法進行分析。而高效液相色譜法，只要求試樣能制成溶液，而不需要氣化，因此不受試樣揮發(fā)性的限制。對于高沸點、熱穩(wěn)定性差、相對分子量大（大于400以上）的有機物（這些物質(zhì)幾乎占有機物總數(shù)的75%～80%）原則上都可應(yīng)用高效液相色譜法來進行分離、分析。據(jù)統(tǒng)計，在已知化合物中，能用氣相色譜分析的約占20%，而能用

4、液相色譜分析的約占70～80%。二、性質(zhì)及原理：高效液相色譜按其固定相的性質(zhì)可分為高效凝膠色譜、疏水性高效液相色譜、反相高效液相色譜、高效離子交換液相色譜、高效親和液相色譜以及高效聚焦液相色譜等類型。用不同類型的高效液相色譜分離或分析各種化合物的原理基本上與相對應(yīng)的普通液相層析的原理相似。其不同之處是高效液相色譜靈敏、快速、分辨率高、重復(fù)性好，且須在色譜儀中進行。高效液相色譜法的主要類型及其分離原理根據(jù)分離機制的不同，高效液相色譜法可分

5、為下述幾種主要類型：1液—液分配色譜法(LiquidliquidPartitionChromatography)及化學(xué)鍵合相色譜(ChemicallyBondedPhaseChromatography)流動相和固定相都是液體。流動相與固定相之間應(yīng)互不相溶（極性不同，避免固定液流失），有一個明顯的分界面。當(dāng)試樣進入色譜柱，溶質(zhì)在兩相間進行分配。LLPC與GPC有相似之處，即分離的順序取決于K，K大的組分保留值大；但也有不同之處，GPC中，

6、流動相對K影響不大，LLPC流動相對K影響較大。a.正相液—液分配色譜法(NmalPhaseliquidChromatography):流動相的極性小于固定液的極性。b.反相液—液分配色譜法(ReversePhaseliquidChromatography):流動相的極性大于固定液的極性。c.液—液分配色譜法的缺點：盡管流動相與固定相的極性要求完全不同，但固定液在流動相中仍有微量溶解；流動相通過色譜柱時的機械沖擊力，會造成固定液流失。上

7、世紀(jì)70年代末發(fā)展的化學(xué)鍵合固定相（見后），可克服上述缺點。現(xiàn)在應(yīng)用很廣泛（70~80%）。2液—固色譜法流動相為液體，固定相為吸附劑（如硅膠、氧化鋁等）。這是根據(jù)物質(zhì)吸附作用的不同來進行分離的。其作用機制是：當(dāng)試樣進入色譜柱時，溶質(zhì)分子(X)和溶劑分子(S)對吸附劑表面活性中心發(fā)生競爭吸附（未進樣時，所有的吸附劑活性中心吸附的是S），可表示如下：子Br則被轉(zhuǎn)化成了相應(yīng)的酸HBr，可用電導(dǎo)法靈敏的檢測。離子色譜法是溶液中陰離子分析的最佳

8、方法。也可用于陽離子分析。6空間排阻色譜法(StericExclusionChromatography)空間排阻色譜法以凝膠(gel)為固定相。它類似于分子篩的作用，但凝膠的孔徑比分子篩要大得多，一般為數(shù)納米到數(shù)百納米。溶質(zhì)在兩相之間不是靠其相互作用力的不同來進行分離，而是按分子大小進行分離。分離只與凝膠的孔徑分布和溶質(zhì)的流動力學(xué)體積或分子大小有關(guān)。試樣進入色譜柱后，隨流動相在凝膠外部間隙以及孔穴旁流過。在試樣中一些太大的分子不能進入膠

9、孔而受到排阻，因此就直接通過柱子，首先在色譜圖上出現(xiàn)，一些很小的分子可以進入所有膠孔并滲透到顆粒中，這些組分在柱上的保留值最大，在色譜圖上最后出現(xiàn)。三、結(jié)構(gòu)系統(tǒng)：高效液相色譜儀主要有進樣系統(tǒng)、輸液系統(tǒng)、分離系統(tǒng)、檢測系統(tǒng)和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，下面將分別敘述其各自的組成與特點。1進樣系統(tǒng)一般采用隔膜注射進樣器或高壓進樣間完成進樣操作，進樣量是恒定的。這對提高分析樣品的重復(fù)性是有益的。2輸液系統(tǒng)該系統(tǒng)包括高壓泵、流動相貯存器和梯度儀三部分。高壓泵

10、的一般壓強為l47～4.4X107Pa，流速可調(diào)且穩(wěn)定，當(dāng)高壓流動相通過層析柱時，可降低樣品在柱中的擴散效應(yīng)，可加快其在柱中的移動速度，這對提高分辨率、回收樣品、保持樣品的生物活性等都是有利的。流動相貯存錯和梯度儀，可使流動相隨固定相和樣品的性質(zhì)而改變，包括改變洗脫液的極性、離子強度、PH值，或改用競爭性抑制劑或變性劑等。這就可使各種物質(zhì)（即使僅有一個基團的差別或是同分異構(gòu)體）都能獲得有效分離。3.分離系統(tǒng)該系統(tǒng)包括色譜柱、連接管和恒溫

11、器等。色譜柱一般長度為10～50cm（需要兩根連用時，可在二者之間加一連接管），內(nèi)徑為2～5mm，由“優(yōu)質(zhì)不銹鋼或厚壁玻璃管或鈦合金等材料制成，住內(nèi)裝有直徑為5～10μm粒度的固定相（由基質(zhì)和固定液構(gòu)成）固定相中的基質(zhì)是由機械強度高的樹脂或硅膠構(gòu)成，它們都有惰性（如硅膠表面的硅酸基因基本已除去）、多孔性（孔徑可達1000）和比表面積大的特點，加之其表面經(jīng)過機械涂漬（與氣相色譜中固定相的制備一樣），或者用化學(xué)法偶聯(lián)各種基因（如磷酸基、季胺

12、基、羥甲基、苯基、氨基或各種長度碳鏈的烷基等）或配體的有機化合物。因此，這類固定相對結(jié)構(gòu)不同的物質(zhì)有良好的選擇性。例如，在多孔性硅膠表面偶聯(lián)豌豆凝集素（PSA）后，就可以把成纖維細(xì)胞中的一種糖蛋白分離出來。另外，固定相基質(zhì)粒小，柱床極易達到均勻、致密狀態(tài)，極易降低渦流擴散效應(yīng)?；|(zhì)粒度小，微孔淺，樣品在微孔區(qū)內(nèi)傳質(zhì)短。這些對縮小譜帶寬度、提高分辨率是有益的。根據(jù)柱效理論分析，基質(zhì)粒度小，塔板理論數(shù)N就越大。這也進一步證明基質(zhì)粒度小，會提

13、高分辨率的道理。再者，高效液相色譜的恒溫器可使溫度從室溫調(diào)到60C，通過改善傳質(zhì)速度，縮短分析時間，就可增加層析柱的效率。4檢測系統(tǒng)高效液相色譜常用的檢測器有紫外檢測器、示差折光檢測器和熒光檢測器三種。（1）紫外檢測器該檢測器適用于對紫外光（或可見光）有吸收性能樣品的檢測。其特點：使用面廣（如蛋白質(zhì)、核酸、氨基酸、核苷酸、多肽、激素等均可使用）；靈敏度高（檢測下限為1010g／ml）；線性范圍寬；對溫度和流速變化不敏感；可檢測梯度溶液洗