穩(wěn)定細胞株篩選

1、穩(wěn)定株構建穩(wěn)定株構建FAQFAQ轉自微博轉自微博思路迪慢病毒包裝思路迪慢病毒包裝1，什么是瞬時轉染和穩(wěn)定轉染？答：瞬時轉染：顧名思義，外源片段的表達時間短暫。這主要是因為外源導入的裸露的載體整合入基因組的幾率非常低，所以以染色體外(episomal)形式存在，不能隨細胞分裂而一同復制導致最后拷貝數被稀釋導致的。而且考慮到細胞分裂會稀釋質粒的量，所以起初轉染的質?？截悢禈O高。這就導致瞬時轉染呈現(xiàn)一個高拷貝到低拷貝迅速降低的過程，且無法在這

2、個系統(tǒng)上實現(xiàn)可誘導表達。穩(wěn)定轉染：是相對瞬時轉染而言，進入細胞的質粒整合入細胞基因組中，并能隨細胞分裂穩(wěn)定傳遞下去。在這個系統(tǒng)中，質粒表達穩(wěn)定，拷貝數低，且能實現(xiàn)誘導表達。穩(wěn)定轉染并不是一種與瞬時轉染不同的方法，只是對瞬時轉染的細胞進行篩選，得到穩(wěn)定整合的細胞株。穩(wěn)定整合的幾率因基因傳遞的方法而異，跨度可以從108到101。因此，對于有的轉染方法，比如化學試劑介導的轉染，其整合幾乎可以忽略不計。質粒載體整合的位點并不是完全隨機分布，依據

3、不同的基因傳遞方法，呈現(xiàn)不同的靶向傾向性，所以是一種半隨機整合。不同基因傳遞方法對質粒穩(wěn)定表達的影響見表XXXX。2，設計穩(wěn)定株構建實驗需要考慮的因素有哪些？?答：穩(wěn)定整合試驗中需要考慮的幾個關鍵因素有：?2)，需要構建使用誘導表達系統(tǒng)，這主要是由于：a)，過表達基因或者干擾目的基因引起細胞毒性或者抑制細胞生長等不利因素?b)，目的基因的過表達或者干擾需要時空特異性。?3)，希望控制目的基因過表達或者干擾的拷貝數，以避免引入人為因素影響

4、實驗結果的精確性。構建穩(wěn)定株可以幫助篩選拷貝數適量的細胞進行實驗研究。?4)，部分細胞種類，病毒載體亦無法達到高轉導效率，通過構建穩(wěn)定株，達到外源片段的高效表達。?5)，長期在少數幾類細胞中研究幾個基因的功能，通過構建穩(wěn)定株，可以大大降低頻繁轉染或者病毒包裝的成本，也極大方便實驗研究。?6)，部分蛋白穩(wěn)定性極強，瞬時RNA干擾因為作用周期短，只能抑制目的基因的表達，但無法去除已經表達的目的蛋白，所以需要通過構建穩(wěn)定株實現(xiàn)更好的基因干擾效