基因工程——重點

1、基因工程大綱基因工程大綱——高國輝老師部分高國輝老師部分名解：1、第一代基因工程（重組DNA）：是指重組DNA技術的產業(yè)化設計與應用，包括上游技術和下游技術兩大組成部分。上游技術指的是基因重組、克隆和表達的設計與構建（即重組DNA技術）；而下游技術則是涉及到基因工程菌或細胞的大規(guī)模培養(yǎng)以及基因產物的分離純化過程。2、第二代基因工程（蛋白質工程）：研究蛋白質的結構及結構與功能的關系，然后人為地設計一個新蛋白質，并按這個設計的蛋白質結構去改

2、變其基因結構，從而產生新的蛋白質或者從蛋白質結構與功能的關系出發(fā)，定向地改造天然蛋白質的結構，特別是對功能基因的修飾，也可以制造新型的蛋白質。3、第三代基因工程（途徑工程）：是多基因的基因工程。通過基因工程的手段來改變分叉代謝途徑的流向或阻斷有害代謝產物的合成等原理，來改變微生物代謝的流向，增加某些產物的產量，也可通過引入外源基因來延伸原來的代謝途徑，產生新的末端代謝產物，或者利用新底物作為生物合成的原料，也可以通過構建新的代謝途徑合成

3、具有新化學結構的代謝產物。4、質粒：是生物細胞內固有的、能獨立于寄主染色體而自主復制、并被穩(wěn)定遺傳的一類核酸分子。5、考斯質粒（cos）：是一類人工構建的含有λDNAcos序列和質粒復制子的特殊類型的載體。6、克隆質粒：常用于克隆和擴增外源基因。它們或者含有氯霉素可擴增的松弛型復制子的結構，或者復制子經過人工誘變，解除對質粒拷貝數的負控制作用，使得質粒在每個細胞中可達數千個復制拷貝。7、穿梭質粒：這類質粒分子上含有兩個親緣關系不同的復制

4、子結構以及相應的選擇性標記基因，可以在兩種不同種屬的受體細胞中復制并檢測。8、表達質粒：這類質粒在多克隆位點的上游和下游分別裝有兩套轉錄效率較高的啟動子，合適的核糖體結合位點（SD序列）以及強有力的終止子結構，使得克隆在合適位點上的任何外源基因均能在受體細胞中高效的表達。9、限制性核酸內切酶：生物體內能識別并切割特異的雙鏈DNA序列的一種內切核酸酶。它是可以將外來的DNA切斷的酶，即能夠限制異源DNA的侵入并使之失去活力，但對自己的DN

5、A卻無損害作用，這樣可以保護細胞原有的遺傳信息。10、Klenow酶：用枯草芽孢桿菌蛋白酶處理切掉大腸桿菌DNA聚合酶ⅠN端的5→3外切酶活性部分。11、T4DNA連接酶：由T4噬菌體基因編碼，相對分子質量為60KD?？梢杂脕硇迯虳NA雙鏈上的單鏈缺口，連接RNADNA雜交雙鏈上的DNA鏈缺口或RNA鏈缺口，也可以用來連接完全斷開的兩個平頭雙鏈DNA分子。12、動物的轉基因技術：利用轉基因的重組子構建技術，重組分子導入動物體內的轉化技術

6、，轉基因在受體細胞染色體上的穩(wěn)定整合及可控制性表達技術統(tǒng)稱為轉基因技術。13、轉基因動物：指以實驗方法導入外源基因，在染色體組內穩(wěn)定整合并能遺傳給后代的一類動物。11、共抑制效應：當受體細胞染色體上含有轉基因的同源伙伴時，轉基因與內源性同源基因的表達將同時受到抑制。12、基因治療：是指將外源正常基因導入靶細胞，以糾正或補償因基因缺陷和異常引起的疾病，以達到治療目的。也就是將外源基因通過基因轉移技術將其插入病人的適當的受體細胞中，使外源基

7、因制造的產物能治療某種疾病。13、Ti的共整合轉化：TDNA在大腸桿菌質粒上，含有E.coli的選擇標記和植物選擇標記Kmr。首先在E.coli中篩選重組分子，然后將重組質粒轉化到農桿菌中，質粒與Ti質粒上的同源序列發(fā)生同源重組，將外源基因整合到Ti質粒上，用于侵染植物細胞。TDNA重組分子整合到植物細胞染色體DNA上，Kmr篩選轉化細胞。14、Ti質粒的二元整合轉化系統(tǒng):即穿梭質粒。插入外源基因的重組穿梭質粒直接轉化含有Ti質粒的根瘤

8、農桿菌，經篩選后直接感染植物細胞。農桿菌侵染植物細胞后，植物的創(chuàng)傷信號啟動Ti質粒上的Vir基因，隨后將穿梭質粒的TDNA切割下來，轉移到植物細胞中。（與共整合系統(tǒng)所不同的是，含外源基因的質?？稍谵r桿菌內自主復制并保留下來。）反式作用因子：具有調節(jié)基因表達作用的蛋白因子。RNA聚合酶。特異性轉錄調節(jié)因子：激活蛋白或阻遏蛋白等。（2）影響轉錄的因素：啟動子——起始部位：1、結合部位：10、識別部位：35；○1啟動子決定轉錄方向及模板鏈；啟

9、動子序列決定啟動效率，不同的啟動子序列對RNA聚合酶親和力不同，因此具有不同的起始頻率；σ因子與啟動子序列特異性識別：○2原核生物只有一種RNA聚合酶，但具有多種σ因子，不同的起始因子選擇性識別不同的啟動子。阻遏蛋白——在轉錄水平對基因表達產生抑制作用的蛋白質：負調控?！?由調控基因(i基因)編碼，阻遏蛋白是DNA結合蛋白，特異性識別并結合操縱子，阻止轉錄。信號分子＋阻遏蛋白——變構——結合DNA（或去結合），從而誘導阻遏和誘導去阻遏。

10、正調控蛋白——結合于特異DNA序列后能促進基因轉錄：正調控?！?CAP蛋白：分解代謝物基因活化蛋白又稱cAMP受體蛋白CRP。ntrC蛋白的調控。倒位蛋白——位點特異性重組酶?！?RNA聚合酶抑制物——細菌處于氨基酸饑餓狀態(tài)時RNA聚合酶活性下降，rRNA和tRNA合成減少或○6停止的現(xiàn)象稱為嚴謹反應。衰減子——位于操縱子第一個結構基因之前，能夠減弱轉錄作用的序列?！?（3）基因表達調控的特點：基因表達調控具有時空兩重性：○1按功能需要

11、，某一特定基因表達的先后次序及相對強弱嚴格受時間的控制，稱為基因表達的時間特異性；某種基因產物在個體生長過程中按不同組織、細胞乃至細胞器的空間順序出現(xiàn)，稱為基因表達的空間特異性?；虮磉_調控的模式復雜性：○2基因表達調控環(huán)節(jié)眾多，其中轉錄調控是關鍵.真核生物與原核生物相比的基因表達調控范圍要大?；虮磉_調控元件可分為核酸和蛋白質兩大類?；虮磉_調控實質是兩者之間的相互作用，包括核酸分子內或分子間的相互作用、核酸和蛋白質之間的相互作用、蛋

12、白分子內或分子間的相互作用。基因表達調控的生物學意義：○3適應環(huán)境，維持生長和增殖、維持個體發(fā)育與分化、調控程序上的缺陷或紊亂將導致嚴重后果；（4）啟動子的調控模型：啟動子的一般特性：RNA聚合酶結合并啟動轉錄的特異DNA序列。有序列特異性、方向特異性、位置特異性、種屬特異性。真核生物的啟動子：根據所對應的基因編碼產物分為：Ⅰ型啟動子（rRNA基因）：核心啟動子：緊鄰轉錄起始位點，足以使轉錄起始。上游控制元件（UCE）：180至107處