氧化石墨烯熒光淬滅

1、1我報告的題目是基于碌酸化多肽降解受阻的石墨稀多肽復合焚光探針用于蛋白激酶活性及抑制作用分析2蛋白激酶催化作用下的蛋白質憐酸化是生物體內翻譯后修飾的重要方式之一。蛋白質的憐酸化和去磷酸化這一可逆過程幾調節(jié)著細胞的發(fā)育、增殖、分化、信號轉導、神經活動、肌肉收縮、細胞凋亡及腫瘤發(fā)生等過程在內的大部分生命活動。非正常的磷酸化會導致人體產生各種疾病例如癌癥或老年癡呆癥等。因此準確靈敏地檢測過度磷酸化、分析蛋白激酶活性和高通量蹄選高效抑制劑對于人

2、類一些重大疾病的早期診斷和治療極為重要。傳統(tǒng)用于蛋白激酶活性分析的方法依賴于放射性元素標記伽馬32PATP法由于放射性物質對環(huán)境及其人體的危害而隨之被取代基于憐酸特異性識別抗體的免疫技術[146]、突光分析方法表面等離子共振技術[184185]以及質譜等都能有效用于蛋白激酶的活性分析。石墨稀(Graphene)是從石墨材料中剝離出來的由碳原子組成的二維晶體是目前己知世界上強度最高的材料。石墨稀具有獨特的電子、機械、熱力學特性在化學、質量

3、、壓力等傳感應用中獨具優(yōu)勢。與碳納米管相似石墨烯對有機熒光分子表現(xiàn)了有效的突光淬滅效果這一過程中同時發(fā)生了激發(fā)態(tài)突光分子與石墨烯表面之間的能量轉移和電子轉移。2010年諾貝爾物理學獎氧化石墨烯薄片是石墨粉末經化學氧化及剝離后的產物，氧化石墨烯是單一的原子層，仍然具有淬滅熒光的效果3本文首次提出了一種基于多肽石墨烯突光浮滅機制和接肽酶降解作用的激酶活性分析方法。酪蛋白激酶CKII是一種重要的絲氨酸蘇氨酸選擇性蛋白激酶能磷酸化160種不同的

4、蛋白質我們以CKII為蛋白激酶模型。FITC標記的CKII底物多肽FITCpeptide(FITCRRRADDSDDDDD)能與GO發(fā)生有效的突光浮滅。幾肽酶CPY是一類肽鏈端解酶作用于任何一個C末端殘基從肽鏈的C端開始逐個降解釋放出游離氨基酸。FITCpeptide在CPY的消化作用下釋放出游離的FITC分子在高離子強度環(huán)境下游離FITC分子與GO之間的吸附較小而保持相當強的焚光。而當FITCpeptide在CKIIATP催化發(fā)生磷酸

5、化有效地阻礙CPY在憐酸化絲氨酸位點的降解使得FITC多肽更容易與GO結合導致焚光淬滅。1羧肽酶CPY作用于任何一個C末端殘基逐個降解釋放游離氨基酸，并釋放出游離的FITC分子，在高離子強度環(huán)境下(猜想，故而加了氯化鎂和鉀)，與GO之間吸附較小保持相當強的熒光4.梭肽酶(carboxypeptidaseYCPY)、Staurospine、弗斯可林(Fsklin)和3異丁基1甲基黃嘿呤(IBMX)購買于西格瑪公司(中國上海)。cAMP依賴

6、型蛋白激酶(PKA催化亞基)購買于Promega公司酷蛋白激酶II(CKII)購買于NewEnglBiolabs公司(美國)。突光素標記底物多肽:FITCRRRADDSDDDDD(FITCpep)、FITCRRRADDpSDDDDD(FITCPpep)和FITCLRRASLG(FITCkemptide)ATP、蛋白酶抑制劑和改良型Bradfd蛋白總濃度檢測試劑盒牛血清蛋白(BSA)、三輕甲基氨基甲焼(Tris)、甘油、DTT、EDTAS

7、ynergyMx酶標儀(BioTek儀器有限公司)進行突光光譜分析所有樣品用480nm作為激發(fā)波長從500nm到700nm(25C)掃描焚光發(fā)射譜圖。5氧化石墨稀與多肽FITCpep之間的勞光淬滅（氧化石墨烯對熒光強度的影響）FlTCpeptideTBSTrisHClMgCbKCl氧化石墨稀在96孔酶標板中加入60nL濃度為的多肽(FlTCpeptide)溶液(溶于TBS即20mMTrisHCl10mMMgCb50mMKClpH7.5)

8、每孔中加入到最強。從焚光強度對Staurospine濃度的對數關系圖得到Staurospine的抑制曲線可以估算出Staurospine對CKII的ICso值(最大抑制的50%對應的濃度)為94nM這與以往文獻報道值接近[24]。另一方面H89對CKII活性的抑制作用在圖5.12B中體現(xiàn)在激酶催化憐酸化反應中改變抑制劑H89的濃度(0200HM)隨著H89濃度旳增加多肽GO復合物的焚光強度也依次增加這表明生物納米材料構建蛋白激酶活性傳感

9、與蛋白質直接電化學H89對激酶CKII催化反應的抑制相應的憐酸化水平逐步降低。通過焚光強度對H89濃度對數關系作圖得到H89的抑制曲線?？梢怨浪愠鯤89對CKII的IC50值是1.18laM這與以往文獻中報道值相當比較Staurospine和H89對CKII活性的抑制作用結果我們發(fā)現(xiàn)兩種小分子抑制劑對CKII的抑制能力是不一樣的Staurospine的ICso值要明顯小于H89的這說明Staurospine的抑制能力更強。因此上述結果證

10、實了我們提出的這種基于CPY消化作用及GO突光萍滅作用的激酶活性分析方法不僅能有效檢測小分子抑制劑而且能用于蹄選激酶抑制劑。10MCF7細胞培養(yǎng)和裂解液的準備MCF7細胞（一種乳腺癌細胞）(1X105個細胞)培養(yǎng)在含有10%的胎牛血清轉錄非必需氨基酸溶液(0.1mM)1%胰島素轉鐵因子硒補充劑青霉素(lOOUmli)鏈霉素(100mgmL_i)兩性霉素B(0.25mgrnL“)的培養(yǎng)液中。細胞在包含5%C02的濕度氛圍中孵育(37C)。

11、用無血清培養(yǎng)基(ImL)代替細胞培養(yǎng)基在刺激之前培養(yǎng)4小時培養(yǎng)基中加入用二甲基亞砜(DMSO)配制的不同濃度的FosklinIBMX（抑制細胞增殖）混合液(lOpLFosklinIBMX最終濃度在圖6A插圖中顯示)來激活細胞內的PKA。DMSO(10laL)代替FosklinIBMX添加到培養(yǎng)基作為未激活樣品。激活30分鐘后將細胞轉移至憐酸鹽緩沖液(DPBS)中通過超聲(200W)2秒X60次每次間隔3秒鐘的方法超聲破碎細胞。再將細胞裂

12、解液在轉速22000rpm^4。C下離心60分鐘取上清液備用。使用改良型Bradfd總蛋白濃度試劑盒來估算細胞裂解液的總蛋白濃度其用牛血清蛋白(BSA)作為標準。不同濃度的BSA標準溶液(530|agniIi)和Bradfd反應物孵育10分鐘用紫外可見光譜得到該溶液在595nm的吸光度標準濃度對吸光度的校正曲線通過線性關系得到。最后將細胞提取物與Bradfd反應試劑混合用上述提到的方法檢測?？偟鞍诐舛韧ㄟ^參照標準曲線計算。所有細胞裂解液

13、的總蛋白濃度稀釋為8mli用于激酶活性實驗11。FITC多肽的突光萍滅程度用(PoPyPo來計算0為FITC多肽與GO結合之前的焚光強度P為FITC多肽與GO結合后的突光強度。如圖5.14所示FITCkemptide在1號裂解樣品參與的憐酸化下經CPY消化和GO的結合后表現(xiàn)的突光萍滅程度最低((PoP)PQ=0.52)隨著激活劑FoskolinIBMX濃度的增加FITC多肽GO復合物的突光浮滅程度依次增加當濃度增加至第5號樣品濃度值時(

14、Ci:sk=10|iMCibmx=20^iM)突光浮滅程度達到最大((P()P)P()=0.84)而再增加激活劑濃度相應的勞光淬滅程度反而有所下降。因此我們提出的基于接肽酶CPY消化作用與氧化石墨稀突光萍滅效應的蛋白激酶活性分析方法能有效檢測MCF7細胞裂解液中激活PKA的活性拓寬了此種分析方法在分析檢測中的應用而CKIIATP催化磷酸化后，有效組織CPY在磷酸化絲氨酸位點降解，使得FITC多肽容易與GO結合導致熒光淬滅酪蛋白激酶CKI