發(fā)酵產氫新菌種及純培養(yǎng)生物制氫工藝研究.pdf

1、能源對于人類生存、經濟繁榮及社會發(fā)展是至關重要的。氫氣作為清潔和可再生的能源己逐漸被人類所接受。任南琪教授開發(fā)的混合培養(yǎng)發(fā)酵法生物制氫技術為解決能源與環(huán)境問題提供了重要的技術選擇。然而，為拓寬生物制氫的微生物種質資源及其產業(yè)化應用，還需要調查混合培養(yǎng)的活性污泥中的微生物多樣性，分離培養(yǎng)出高效產氫特定微生物菌種，研究這些產氫細菌的種屬分類地位和產氫特性，進一步應用于純培養(yǎng)制氫工程。 本文首先調查了混合培養(yǎng)系統(tǒng)中的乙醇型發(fā)酵穩(wěn)定產氫

2、的微生物多樣性，對產氫細菌培養(yǎng)基進行簡化，重新配制HPB-LR培養(yǎng)基，建立平板培養(yǎng)瓶法(PCBM)厭氧技術和改良Hungater滾管法，從混合培養(yǎng)系統(tǒng)污泥中分離培養(yǎng)出270株純培養(yǎng)物；采用氣相色譜儀器分析這些菌株的液相末端產物的組成、數量和相互間的比值，判斷細菌的發(fā)酵類型，進而將分離的菌株劃分為12種生化類型；對其中不同類型的8株菌進行16SrDNA堿基測序和系統(tǒng)發(fā)育學分析，發(fā)現均為新菌種，其中4株屬于新型厭氧產氫菌，1株屬于梭菌屬厭氧

3、產氫菌，1株屬于丙酸桿菌屬，1株屬于乳酸菌屬，1株屬于克雷伯氏菌屬。對產氫效率較高的新型厭氧產氫菌株Rennanqilyf3(簡寫為R3)和Rennanqilyf12(簡寫為R12)進行了生理生化鑒定、16SrDNA和16S-23SrDNA間隔區(qū)的堿基測序等分子生物學和系統(tǒng)發(fā)育學分析，表明R3和R12分別是2個獨立的種。菌株R3的16SrDNA和最長16S-23SrDNA間隔區(qū)的堿基分別為1525bp和1262bp，NCBI的登錄號分別

4、為AY363375和AY365107菌株R12的16SrDNA為1506bp，NCBI的登錄號為AY332392。 利用間歇培養(yǎng)試驗研究了發(fā)酵產氫新菌種R3的產氫能力及其調控方法。菌株R3在葡萄糖濃度為12.0g/L時，產氫量最大；葡萄糖濃度為15.0g/L時，細胞生長量最大。與無機氮源相比，有機氮源氫氣產量較高，而酵母粉是R3氫氣生產和細胞生長的最有效的有機氮源。微生物生長和產氫起始發(fā)酵液的最佳pH值為5.5左右，培養(yǎng)溫度在3

5、0～35℃之間為宜。碳酸鹽對菌株R3的產氫量和生物氣中氫氣的含量有不利影響，磷酸鹽對產氫量有明顯的促進作用，緩沖液K2HPO4-KH2PO4的濃度為0.15mol時較適宜。當發(fā)酵液的碳氮質量比(C/N)為3.3時，葡萄糖利用率最高，生物氣體產量和氫氣產量最大；碳源類型對菌株的氫氣產量和含量也有具有較大的影響，六碳糖和雙糖產氫量和氫氣含量比五碳糖高。 分批培養(yǎng)(平均產氫速率高)、補料分批培養(yǎng)(產氫量高)和連續(xù)培養(yǎng)(比產氫率高)純培

6、養(yǎng)生物制氫工藝因各自的產氫優(yōu)勢，可以應用于生物制氫工程中，發(fā)酵產氫新菌種R3能夠成為純培養(yǎng)工藝應用的工程菌。 純培養(yǎng)生物制氫工藝的主要工程控制對策為：按反應溶液體積的2％接種新鮮產氫細菌種子培養(yǎng)液，底物濃度采用10％～15％，反應啟動時間15-17h，溫度35℃，pH4～4.5，啟動階段溶解氧達到10％左右；在補料分批培養(yǎng)過程中，補料時間按發(fā)酵產氫量來確定，當產氫量下降到0.2ml/h時，進行補料和排液操作，流加量應為培養(yǎng)液總量