hpv16e7的dna改組及質(zhì)粒pcdna3.1hpv16e7sh的構(gòu)建

1、河北醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文HPV16E7的DNA改組及質(zhì)粒pcDNA3.1-HPV16E7sh的構(gòu)建姓名：張佃財(cái)申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專(zhuān)業(yè)：皮膚病與性病學(xué)指導(dǎo)教師：李艷佳20090301中文摘要P C R - 在5 0 山P C R 反應(yīng)體系中，加入1 0 9 l 酶切后純化回收的小片段，1 0 x P C R b u f i e r ，d N T P s ，T a q 酶，純水補(bǔ)足5 0 山。反應(yīng)條件：9 4 ℃預(yù)變性3 分鐘，9 4 ℃3

2、 0 秒，5 2 ℃3 0 秒，7 2 ℃3 5秒，，4 0 個(gè)循環(huán)，7 2 ℃延伸1 0 分鐘。有引物P C R ．取無(wú)引物P C R 產(chǎn)物1 ：1 0 0 稀釋?zhuān)? 0 山P C R 反應(yīng)體系中加入引物，上下引物，T a q 酶， 5 山稀釋后的無(wú)引物P C R 產(chǎn)物，1 0 x P C Rb u f f e r ，d N T P s 。反應(yīng)條件：9 4 * ( 2 預(yù)變性3 分鐘，9 4 ℃4 5 秒，5 5 ℃1 分鐘，7 2

3、℃1 分鐘， 2 0 個(gè)循環(huán)，7 2 ℃延伸1 0 分鐘。電泳觀察，如果條帶不清，可取本步的反應(yīng)產(chǎn)物1 0 山，進(jìn)行第二輪有引物P C R ，反應(yīng)條件同上。擴(kuò)增產(chǎn)物切膠回收約3 0 0 b p 的片段。2 ．p c D N A 3 ．1 ．H P V l 6 E 7 s h 質(zhì)粒的構(gòu)建及篩選鑒定P C R 擴(kuò)增產(chǎn)物D N A 純化產(chǎn)物及質(zhì)粒載體p c D N A 3 ．1 的酶切限制性?xún)?nèi)切酶反應(yīng)在滅菌的0 ．5 m l 離心管中進(jìn)行，在

4、5 0 9 l 酶切反應(yīng)體系中，加入H P V l 6 E 7 D N A ( 5 0 0 n g ／9 1 ) 3 2 9 l ，B a m H I 酶，E c o R I 酶，1 ×T a n g o 硼，輕輕混勻， 3 7 ℃水浴消化2 小時(shí)。酶切完成后分別直接從溶液中純化回收酶切后片段，同樣方法雙酶切p c D N A 3 ．1 。連接反應(yīng)：連接反應(yīng)體系：p c D N A 3 ．1 酶切產(chǎn)物( 1 0 0 n g ／

5、9 1 ) 1 ．5 I - t l ，H P V l 6 E 7 酶切產(chǎn)物( 7 0 n g ／9 1 ) 0 ．5 “l(fā) ，T 4D N A 連接酶( 3 u ／} t 1 ) 0 ．2 山超純水補(bǔ)足1 0 } t l ，4 5 口保溫5 分鐘，以使重新退火的粘端解鏈。將混和物冷卻至O 口。反應(yīng)條件：1 5 口水浴1 2 小時(shí)。C a C l 2 法制備E ．c o l iD H S t x 感受態(tài)細(xì)胞及重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化和篩選鑒定用常