內(nèi)蒙古大學基因工程大實驗思考題

1、 本科生基因工程實驗(記錄及課后思考題)姓名:學號:專業(yè):完成日期:2012 年 9 月 9 日指導老師:2. 引物序列是根據(jù)什么設計的？為什么要加上酶切位點序列？根據(jù) cDNA 設計引物，為了更好地與載體連接。 3. 為什么要在最后延伸 10min？一般在擴增反應完成后,都需要一步較長時間(10-30min)的延伸反應,以獲得盡可能完整的產(chǎn)物。 4. 實驗中是否有非特異性擴增產(chǎn)物或引物二聚體帶？如何才能

2、消除？有①.重新設計引物②加大模板用量或減少引物用量③擴大反應體系 ④提高退火溫度或 Mg 離子濃度五、從瓊脂糖凝膠中回收 五、從瓊脂糖凝膠中回收 DNA DNA 片段 片段1.為何避免用 EB 染色及用紫外燈照射欲回收的目的 DNA？紫外照射對 DNA 有損傷， ，為了保證 DNA 的完整性，盡量不用 EB 染色或紫外照射。六、目的基因片段與載體連接 六、目的基因片段與載體連接1．連接酶的最適活性溫度是多少？37℃2．為什么要采用 1

3、4℃下連接？由于熱穩(wěn)定性較差，因此長時間反應時通常需在 14°C 下進行3．如何確定插入片段的用量與質(zhì)粒載體的用量？一般參考 T4 連接酶的說明書，大多數(shù)人做的是插入片段：載體=3：1 至5：1，是分子數(shù)的比值?？梢韵葴y出兩者的質(zhì)量濃度（分光光度計或者跑電泳） ，然后根據(jù)分子量大小可以算出。七、感受態(tài)大腸桿菌的制備 七、感受態(tài)大腸桿菌的制備1. 制作感受態(tài)菌的過程中，應注意哪些關鍵步驟？①操作是防止污染，這個最容易影響感受態(tài)制

4、作的因素。②懸浮沉淀的過程，一定要輕輕懸浮，最好輕搖懸浮。2. CaCl2 溶液的作用是什么？為什么要冰冷的？作用：懸浮菌體 在 0～4℃，CaCl2 低滲溶液中，細胞膨脹成球狀，轉化混合物中的 DNA 形成抗 DNA 酶的羥基－鈣磷酸復合物黏附于細胞表面，較低的溫度也降低了相關 酶的活性較好的保存了 DNA，冰浴過程中，原來加在溶液中的鈣離子和細菌細 胞膜結合，在低溫下形成液晶結構，這樣，在 42 度熱激下，這種液晶結構收縮，將細胞膜

5、扯開孔道，使 DNA 進入細菌細胞中。八、感受態(tài)細菌的轉化 八、感受態(tài)細菌的轉化1.影響轉化效率的因素有哪些？①細菌的生長狀態(tài)：實驗中應密切注視細菌的生長狀態(tài)和密度，盡量使用對數(shù) 生長期的細 胞 （一般通過檢測 OD600 來控制。 DH5α菌株 OD600 為 0.5 時細胞密度是 5×107/ml）； ②所有操作均應在無菌條件和冰上進行； ③經(jīng) CaCl2 處理的細胞，在低溫條件下，一定的時間內(nèi)轉化率