芝麻、花生、豌豆物種特異性PCR和實時熒光定量PCR檢測方法研究.pdf

1、目前，隨著人們生活水平的提高，食品質量與安全問題常常困擾著每一位消費者。在食品加工過程中，以次充好，以假亂真的現(xiàn)象屢見不鮮。因此，食品質量的問題也備受人們關注。芝麻、花生、豌豆營養(yǎng)豐富，是食品中常用的原材料，也是日常生活中人們喜愛的食材，如芝麻油、芝麻醬、綠豆糕點制品等。但市場上的芝麻油、芝麻醬、綠豆糕點也常常出現(xiàn)質量問題，能否定性、定量的快速、準確的檢測食品中的芝麻、花生、豌豆成分，對于確保食品質量，保證人們健康飲食有著至關重要的作用

2、。
　　本試驗通過對芝麻（Sesamum indicum）的2S albumin-like序列、花生(Arachis hypogaea)的主要致敏基因(Arah1gene)以及豌豆(Pisum sativum)葉綠體中隔離HS878的tRNA-Leu(trnL)基因和trnL-trnF序列基因的間隔區(qū)（trnL-trnF intergenic spacer,partial sequence）特異性序列的分析，設計出芝麻、花生的定性

3、PCR引物及實時熒光PCR引物以及豌豆的定性PCR引物。通過對引物的特異性、最適反應濃度和最適退火溫度進行了篩選和優(yōu)化，建立物種特異性PCR檢測方法。進一步對方法的靈敏度、檢出限和對市售樣品的適用性進行測試。
　　(1)建立了芝麻物種特異性定性PCR檢測方法及實時熒光PCR檢測方法。試驗證明，芝麻物種特異性定性PCR檢測方法所設計篩選的引物sesame-1F/1R物種特異性良好，在優(yōu)化后的擴增條件下能夠檢測出芝麻質量分數為0.1％

4、(50ng/μL)的樣品，應用于芝麻加工品檢測，結果可信。試驗證明，芝麻物種特異性實時熒光PCR檢測方法所設計篩選的引物、探針sesameQ1-F/R/P物種特異性良好。擴增條件經優(yōu)化后，建立了Ct值與芝麻DNA的質量之間的量化關系方程式y(tǒng)=-3.38x+30.928，R2=0.997，擴增效率E％為97.625％,據此計算得到其最低檢出限可至2.7×104copies的芝麻DNA。通過對市售樣品的檢測證明了所建立方法的適用性及可行性。

5、
　　(2)建立了花生物種特異性定性PCR檢測方法及實時熒光PCR檢測方法。結果證明，花生物種特異性定性PCR檢測方法所設計篩選的引物peanut F/R物種特異性良好，在優(yōu)化后的擴增條件下能夠檢測出花生質量分數為0.1％(50ng/μL)的樣品，可用于加工品檢測且結果可靠;試驗證明，花生物種特異性實時熒光PCR檢測方法所設計篩選的引物、探針peanutQ2-F/R/P物種特異性良好，在優(yōu)化后的擴增條件下其最低檢出限可至88.98

6、copies的花生DNA。為了對花生DNA進行定量檢測而進行標準曲線的繪制，其方程為:y=-3.382x+28.267，R2=0.991，擴增效率E％為97.5％，并用已知含量的混樣對標準曲線進行驗證。通過對市售樣品的檢測證明了所建立方法的適用性及可行性。
　　(3)建立了豌豆物種特異性定性PCR檢測方法。該方法所設計篩選的引物pease-F/R物種特異性良好，在優(yōu)化后的擴增條件下能夠檢測出花生質量分數為1％(50ng/μL)的樣

7、品。結果表明用該方法對豌豆加工品的檢測結果可信。
　　根據上述試驗結果，得到如下結論:
　　1.對芝麻、花生以及豌豆的定性檢測研究表明，所建立的體系特異性好，靈敏度高，可滿足對不同市售食品中目標物種的定性檢測需要，可用于鑒別相關食品成分及鑒定食品標簽的真?zhèn)巍?br>　　2.芝麻、花生的實時熒光定量檢測研究顯示，針對單拷貝基因所設計的引物探針體系特異性高，能滿足定量檢測要求。通過繪制標準曲線，算得所檢測樣品DNA中目的物種含量