hiv-1b亞型包膜糖蛋白gp41基因真核表達載體的構建與鑒定

1、· 4 5 8 -H I V一1B亞型包 膜糖蛋 白 g p 41 基 因真核表 達 載體 的構建 與鑒定 *李德 良 馬文麗△師永霞李凌 鄭文嶺 南方 醫(yī)科大 學基 因工程研 究所( 廣 州 5 1 0 5 1 5 )【 摘要】目的克隆人類免疫缺陷病毒 I 型 B亞型包膜糖蛋 白 g p 4 1 基因并構建真核表達我體 ， 進一步為制備 自 行 設計的 以噬 茵體作 為栽 體的 H I V核 酸疫苗奠定基礎 。方法 以克隆好

2、的 H I V 一1 B亞型 U 2 6 9 4 2 全基 因 質 粒 D N A作 為模板 ， 根據 G e n b a n k中 g p 4 1 基 因的核苷 酸序列設計 引物 ， 并在 引物的 5端分 別引入 K p nI 及 X h oI 酶 切位 點 ， 特異性 的擴增 S p 4 1 基 因。T A克隆后經雙酶切 、 測序等 鑒定 重組質粒 ， 再 經雙酶切 、 連接 構建含 g p 4 1 編碼 基因的真核表 達栽體 ，

3、并進行 酶切及 測序鑒定分析 p e D N A31 ( +) ／ s ~ 1 。結果 重組 質粒經 K p n I， X h o I雙酶切 成 5 、 4l c b與 1 ． 0k b 的片斷， 表明表達載體 p e D N A 31 ( +) 中 插入 了g p 4 1 基 因片斷， 測序結果表 明編碼框正確。結 論 成功構建 了 H I V 一1B 亞型 包膜糖蛋 白 g p 4 1 基 因的真核表達栽體 p c D N A 3

4、． 1 ( +) ／ g p 4 1 ?！?關鍵詞】 人類免疫缺陷病毒 p e D N A 31 ( +)g l M 1當前 ， 在全 球范 圍內， A I D S 是 十大主要死 因之 一。自 1 9 8 5年 中國大 陸 發(fā)現(xiàn)第 1 例艾 滋病 病 毒感 染 者 開 始 ， 艾 滋病 病 毒感 染者 的數(shù) 字呈 幾 何 級數(shù) 的增 長 ， 到 2 0 0 2 年 底 ， 艾 滋病感染 人數(shù)全 球達 到了 50 0 0萬 ， 死 亡

5、超過了 26 0 0萬 ， 而且沒有特別有 效 的藥 物 出現(xiàn) ， 所 以A I DS的防治 ， 尤 其 疫 苗 的 研 發(fā) ， 一 直 都 是 研 究 的 熱 點【 1 j 。包膜糖 蛋白 g r , 4 1 鑲 嵌于病 毒 的脂 質雙層 中， 稱 跨膜蛋 白， 在病毒感 染過程 中能 夠介導 病毒 脂膜 與 細 胞膜 的融合 ， 因此是 H I V治療 的理想靶 抗原 。核酸 疫 苗是近年來 才發(fā)展起 來 的新型 疫苗 ， 可 以激

6、 發(fā)強 烈 的 免疫應 答 ， 并在動物模 型中取得 了滿意的結果 2。H I V核酸疫 苗的研 究很 多 ， 所用 載體 一般 為質粒 或者 病 毒 載體 ， 而 噬菌體作為一種全新 的核酸疫苗的載體研究 甚少 ， 尤 其 口服疫苗 的研究 就更 少 。本 研究 旨在 采 用 p e D N A 3 ． 1 ( +) 載體 構建 包 膜糖 蛋 白 g p 4 1真核 表 達 載 體， 使 g t M 1 基因在 C MV啟動子的控

7、制之下 ， 為進一步制 備 噬菌體作為載體 的核酸疫苗 的研制奠定基礎。1 材料與方法 1 ． 1 材料 1 ． 1 ． 1 質粒載體 實驗中選用 的基因組為 H I V一1 B亞 型 I全基因 D N A ， 該 質粒 由美 國 J e a nKC a r r 博 士 惠贈 ， 真核表達質粒 p c D N A 3 ． 1 ( +) 購 自 I n v i t m g e n 公 司 ，克隆載體 p M I ) 一 1 8 Tv e

8、c t o r 購 白大連寶生物科 技公司。1 ． 1 ． 2 細胞株 大腸桿 菌菌株 X L 1 一 b l u e由本室保 存。1 ． 1 ． 3引 物 的 設 計 與 合 成 上 游 引 物 ： 5G G T A C —C A T C W , C ~G ~ _ W _ W _ ． A A T A G G A G C3中引入 了 K p n工酶切位 點。下 游引物 ： 5C T C G A G T r A T A G C h A _

9、 A A T C C T I q E3中 引入了 X h o I 酶切 位點 。P E R引物 由上 海博 亞生 物科 技公司合成。1 ． 1 ． 4 工具酶和主要試劑高保真 P c R試劑盒購 自R o c h e 公司。限制性 內切酶 K p nI和 X h oI， T 4 D N A連 * 國家 自然科學基金資助項 目( 編號 ： 3 9 8 8 0 0 3 2 )△通訊作者 ， 電話 ： ( y 2 0 — 6 1 6 4 8

10、2 1 0 ； E — m a i l ： w e n l i @f i m r n u ． C O F I I接酶均購 白大 連寶 生 物科 技公 司。質粒純 化試 劑 盒、D N A切膠 回收試 劑 盒 、 D L 2 0 0 0Ma r k e r 及 入 一E c o T 1 4ID N Ad i g e s tMa r k e r 購 白大連寶 生物公 司 。瓊脂 糖和 L B培養(yǎng)基購 白 L i f eT e c h n o

11、 l o g y 公司。其他試劑均為國內分析純 。1 ． 2 方 法 1 ． 2 ． 1 質粒的擴增及 純化 氯化鈣法制備感受態(tài)細 胞 X L 1 一b l u e ； H I V一1 B亞型 U 2 6 9 4 2 全基 因 D N A質粒 ，p e D N A 31 ( +) 質粒轉化宿 主菌 、 篩選 陽性菌 落、 小量制 備質粒 D N A， 瓊 脂糖凝 膠 電泳分 析選 出含相應 質粒 的陽性細菌克隆 。1 ． 2 ． 2目的

12、基 因的擴增及 純化 用 P c R方法以 H I V 一1 B亞型 U 2 6 9 4 2 全 基因 D N A為模板擴增 s p 4 t 基 因序列 ，在上游引入 I 酶 切位點， 在下游引入 Ⅺ 酶 切位點。s p 4 1 的上游引物為 5 ’ G G T A C C A 1 D G C AH A 衄^ G ( ； A G C3； 下 游 引 物 為 5C T C G A G T r A T A c c A A A AC 

13、9; I T r C3：P C R的反應 程 序 如 下 ： 9 4 o C變性 3 0s ； 5 5 o c復 性 3 0s ；7 2 o C 延伸反應 1 2 0S ， 共循 環(huán) 3 0次 。最 后 于 7 2 ~ C延伸 反應 7m i n ， 產物經 電泳切膠 回收純化。1 ． 2 ． 3 克隆載體 的構 建與鑒 定 以 p MD 1 8 ． T為克 隆 載體 ， 與 s p 4 1 的 P C R產物連接 ， 產 物轉化 X

14、L 1 一b l u e 細 菌 ， 經氨芐青霉 索及 a 一互 補籃 白斑篩選 陽性 克 隆， 擴 大培 養(yǎng) ， 提取質粒 ， 酶切鑒定并進行測序( 由本室完成) 。1 ． 2 ． 4 真核表達載體的構建與鑒定 用 K p nI 和 X h oI雙酶切 p c D N A 3 ． 1 ( +) 質 粒及 p M D 1 8 一T ／ S p 4 1 質粒 ，瓊脂糖 電泳 回收片斷 ， 用 T 4 D N A連 接酶將 兩 目的片斷 連

15、接 ， 產物轉化 X L 1 一b l u e 細菌， 經氨芐青霉素培養(yǎng)基 篩選 ， 挑取陽性克隆進行質粒的小量制備， 將重組質粒 進行 雙酶切鑒定及測序分析 。2 結果 2 ． 1g r , 4 1 基 因的擴 增和 T A克 隆雙酶切 、 測序 鑒 定 以 H I V一1 B亞 型 U 2 6 9 4 2全 基 因 D N A為模板 進行 P C R擴增 ， P ER產物進 行 1 ％瓊脂糖 電泳 ， 對照 D N A分子量 維普資

16、訊 http://www.cqvip.com ·4 6 0 ·[ j ] MA Ⅺ Ⅱ ^PH ． V a c c i n e s ， c o m i n g0 fa g ea f t e r2 0 0y e n~ [ J ] ． F E M SM i —e m b i dR， 2 O O O ， ： 2 4 - ( 1 ) ： 9 一 ： 2 0 ．[ 3 ] D I E T R I C HG ， G E N E

17、S C H E VI ， H E S SJ ． D e l i v e r yo fD N Av a c c i n e 8b ya t t e n u a t e di n t r a c d l u l a rb a c t e r i a l J ] ． I r r n n u n o lT o d a y ， 1 9 9 9 ， 2 0 ( 6 ) ： 2 5 1— 2 5 3．[ 4 ] WO L F FJ A ， M A L

18、 O N ERW， WI L L I A M SP， e ta 1 ． D i r e c tg e n e t r B r ~e l “i n t o I I l 叫 s em u s c l ei nv i v o [ J ] ． S c i e n c e ， 1 9 9 0 ， 2 4 7 ( 4 9 4 9 ) ： 1 4 6 5 —1 4 6 8．[ 5 ] 5T I G H EH ， C O R RM， R O M A N

19、M ，e ta 1 ．G e n ev a c c i n a t i o n ： p l a s m i dD N Ai st h a n j u s t8b l u e p r l n t [ J ] ． h I Ⅱ m m 0 】 T o d a y ， 1 9 9 8 ， 1 9 ( 2 ) ：8 9—9 7．[ 6 ] M A N I C K A NE ， K A R F ~ IKL ， R O U S EBT ． D N A

20、v s P _ , c i n l ~一am o d e r no n gMe d i c a lJ o u r n a lA p t ． 2 0 O 6 ， V o 1 ． 2 7 ， N o ． 4g i m m i c ko rab o o nt ov ~c i n o l o g y ? [ J ] ． C r i tR e vl m m u n d ， 1 9 9 7 ， 1 7( 2 ) 1 3 9 —1 5 4 ．[ 7

21、] J E P S O NCD ， M A R C HJB ． B a c t e r i o p h a g el a m b d ai sah i #ys t a b l eD N Av a c c i n ed e l i v e r yv e ~ d e [ J ] ．V a c c i n e ， 2 0 O 4， 2 2 ( 1 9 ) ： 2 41 3 —2 41 9．1 8JV O R N H A G E NR ， H

22、I N D E R E RW，N E B D - S C H I C K E LH ，e ta 1 ．D e -v e l o pme n t0 fe f f i c i e n tH Ⅳ 一s p e c i f i ct e s ts y s t e m su s i n g~c o mb i n a n tv i —r a la n t i g ~ n s [ J J ． B i o t e s tB u l l e t i n

23、， 1 9 9 0 ， 4 ： 9 1 — 9 6 ．[ 9 ] C H A NDc ， F A S SD ， B E R G E RJM， da 1 ． C o r es U ' u c t u r eo f g p 4 1f r o mt h e H I Ve n v e l o p eg l y c o p r o t e i n [ J J ． C e l l ， 1 9 9 7 ， 8 9 ： 2 6 3 — 2 7

24、3 ．( 收稿 1 3 期 ： 2 0 0 5 — 0 9 — 2 1 編輯 ： 祝華)鈣激活性鉀通道在緩 激肽選擇性開放 血腦腫瘤 屏 障 中的作用 粱君 谷艷婷 張樺 薛一雪 劉云會 中國醫(yī)科大 學附屬第 一醫(yī)院神經外科 ，神經生物 學教研 室( 沈 陽 1 1 0 0 0 1 )【 摘要】目的 探討鈣激活性鉀通道( K c t ) 在緩激肽( b r a d y k i n i n ， B K ) 選擇性開放血腦腫瘤屏障( b l

25、 o o d —b r a i nt u m o rb a l T i ~ r ， B T B ) 中的作用。方法 建立腦膠質瘤大鼠模型， 頸內動脈灌注 B K后采用免疫組化 A B C法和 W e ． s t e mb l o t 法測定腫瘤組織 K c a 通道蛋 白的分布和含 量的變化 ， 以 t 檢驗進 行 統(tǒng)計 分析 。結 果 腦膠 質 瘤大 鼠模 型經頸內動脈灌注 B K 后， 其腫瘤內血管內皮細胞的 K c B 通道蛋白增

26、加， 且以灌注后 1 0m i n增加最為顯著。結論 K c B 通 道的表達增多是 B K選擇性開放 B T B機制中的一個重要環(huán)節(jié)?！?關鍵詞】 血腦腫瘤屏障 緩激肽 鈣激活性鉀通道 血腦屏障( b l o o d —b r a i nb a r r i e r ， B B B ) 是各 種藥物 進 入腦組 織的最大 障礙 ， 腦 腫瘤 與血 管之 間也存 在著 血 腦腫瘤屏障( 啪 ) ， 它阻礙化療藥物進入腫瘤。近來的研究 已發(fā)

27、 現(xiàn)小劑 量緩 激肽 ( B K) 可 以選 擇性 開放 B T B ，它是 通過增 加腦 腫瘤毛細血管 內皮細胞 中的吞飲 小泡 的數(shù)量來 實現(xiàn)的。其 機制還不清楚 。但初 步的研究 表 明， 鈣激活性鉀通道( K) 可能是影響 B I B開放的一個 重要環(huán)節(jié)。本實 驗首 次通 過建立 腦 膠質 瘤大 鼠模 型 ，頸 內動脈灌注 B K后測定腫瘤組織 K c a 通 道蛋 白的分布 和含量的變化 ， 來探討 B I B開放的部分 機制

28、。1 材料 與方法 1 ． 1細胞和動 物 細 胞采用 中國 醫(yī)科 大 學神 經生 物 教研室凍存 C 6 腦膠質瘤細胞 ， 實驗動 物采用 中國醫(yī)科 大學實 驗 動 物 中 心 Wi s t a r 雌 性 大 鼠， 體 重 在 1 8 0～2 2 0g 。1 ． 2 試 劑和儀 器 主要 試 劑為 l 0 ％胎牛 血 清 ， R P MI一 1 6 4 0培養(yǎng)基購于 中山生物工 程有 限公 司， 抗 K通道 抗體 購于 S i g

29、m a 公 司 ， A B C免疫組化試劑 盒購于武漢博 士德生 物工程 有 限公 司 ； 主 要儀 器 為美 國 S IK 1 8離 心 機 ，日本 S A N Y OM C O一1 5 A C C O 2孵 育 箱 ， 日本 N A R I S H I G E 立 體定位 儀 ， 瑞 典 L K B電泳儀 ， 德 國 L E I C A冰 凍 切 片 機 。1 ． 3方 法 1 ． 3 ． 1 大鼠 c 6 腦膠質瘤細胞的培養(yǎng) 在含

30、 1 0 ％胎牛血清 的 R P MI 一1 6 4 0培養(yǎng) 基 ， 3 7 ℃ ， 濕 度 1 0 0 ％ ， 5 ％c條件下培養(yǎng) 。1 ． 3 ． 2 大鼠 C 6 腦膠質瘤模型的建立 將濃度為 1 0個／ 1 0的 c 6 細胞 ， 應用立體定 位儀 注入大 鼠右側尾 狀核 內， 靶 點 為 ： 前 囟前 1i n l n ， 矢 狀縫 旁 開 3i n l n ， 深 4． 5i n l n o1 ． 3 ． 3A B C 免疫

31、組織化學染色腫瘤移植 2 周后將 大鼠麻醉， 頸內動脈灌注 B K ( 1 0r e ／ k s ) 后， 斷頭取腦瘤 標本。以下 6 組每組 8 只大鼠： 正常腦組( A組) ： 灌注 B K1 0m i n正常腦 組 織 ； 未 灌 注腫 瘤組 ( B組 ) ： 未灌 注 B K的腦膠質瘤移植大鼠； C ， D ， E ， F 組分別為腦膠質瘤 移植 大鼠灌注 B K 5 ， 1 0 ， 1 5 ， 3 0m i n組 。取標本后迅

32、速冷 凍 ， 切 片 ， 采 用 免 疫 組 化 A B C法進 行 K c a 通 道 蛋 白染 色 ， 光鏡下觀察其 陽性 表達及分布情況 ， 采用 軟件 M o t —i cI m a g eA d v a n c e d3 ． 2測量 血 管 區(qū)域 染 色平 均 光密 度 值 。1 ． 3 ． 4We s t e r nb l o t 對上述所取樣 品采 用 We s t e r n b l o t法進行 K c通道蛋 白的檢