基于免疫PCR生物條形碼技術(shù)檢測(cè)多氯聯(lián)苯的研究.pdf

1、多氯聯(lián)苯（PCBs）是一類人工合成的有機(jī)氯化合物，它具有優(yōu)良的物理化學(xué)性質(zhì)，曾經(jīng)廣泛的應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)中。雖然PCBs已經(jīng)被禁止使用了近40年，但仍能在環(huán)境的各個(gè)角落檢測(cè)到它的存在。PCBs在環(huán)境中難降解，并具有生物蓄積性和高毒性，給生態(tài)環(huán)境和人類健康帶來(lái)了巨大的威脅。PCBs也因此成為各個(gè)國(guó)家和地區(qū)重點(diǎn)監(jiān)測(cè)的污染物之一。
　　目前檢測(cè)PCBs的主要方法為氣相色譜法，但該方法對(duì)樣品前處理要求苛刻，所需儀器價(jià)格昂貴，檢測(cè)成本高，檢測(cè)周

2、期長(zhǎng)，不適合對(duì)樣品的快速高通量分析檢測(cè)。而免疫分析方法具有操作簡(jiǎn)單、成本低、靈敏度高、能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)目標(biāo)分子的快速高通量分析檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，目前已廣泛的用于環(huán)境污染物的分析檢測(cè)。因此，建立快速簡(jiǎn)便的免疫分析方法來(lái)檢測(cè)PCBs具有重要的意義和廣闊的應(yīng)用前景。
　　本文制備了三種分別針對(duì)PCB12、PCB37和PCB77的多克隆抗體和一種抗PCB37的單克隆抗體，在此基礎(chǔ)上建立了檢測(cè)PCB12、PCB37、PCB77的間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附法（

3、ic-ELISA）；將制備的抗體進(jìn)行生物素化處理，建立了檢測(cè)PCBs的生物素-親和素放大酶聯(lián)免疫吸附法（BA-ELISA）；將不同的抗體和DNA修飾在金納米顆粒（GNPs）表面，制備了多種抗體-GNPs-DNA探針，用于取代傳統(tǒng)免疫 PCR中的抗體-DNA結(jié)合物，基于這些探針，建立了基于實(shí)時(shí)熒光定量免疫PCR（rt-IPCR）的生物條形碼方法（BCA）來(lái)檢測(cè)環(huán)境中的PCBs。將這些方法用于實(shí)際環(huán)境樣品中PCBs的分析檢測(cè)，取得了滿意的結(jié)

4、果，為實(shí)現(xiàn)快速、高通量分析檢測(cè)環(huán)境中的PCBs提供了可靠的技術(shù)支撐。主要研究結(jié)果如下：
　　（1）以牛血清白蛋白（BSA）和卵清蛋白（OVA）為載體蛋白，分別用活化酯法和混合酸酐法制備了三種PCBs單體的人工免疫原和包被原，產(chǎn)物通過(guò)紫外光譜掃描分析確定半抗原與蛋白質(zhì)成功偶聯(lián)；通過(guò)免疫新西蘭大白兔，制備了三種分別抗PCB12、抗PCB37和抗PCB77的多克隆抗體，所得的抗體特異性較好，效價(jià)較高，均能達(dá)到1:256000；本文還通過(guò)

5、免疫小鼠，細(xì)胞融合，雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)，采集腹水，制備了抗PCB37單克隆抗體，和多克隆抗體相比，該抗體對(duì)PCB37的特異性更好。
　　（2）利用所獲得的抗體，分別建立了檢測(cè)PCB12、PCB37和PCB77的ic-ELISA方法。優(yōu)化了抗原抗體濃度，溫育時(shí)間，封閉液，有機(jī)溶劑，鹽離子強(qiáng)度，pH值等實(shí)驗(yàn)條件，在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，分別建立了檢測(cè)PCB12、PCB37和PCB77的標(biāo)準(zhǔn)曲線；基于多克隆抗體，該方法對(duì)這三種PCBs單體的LOD

6、分別為0.016μg L-1、0.048μg L-1、0.063μg L-1?；趩慰寺】贵w，該方法對(duì)PCB37的LOD為0.027μg L-1；將該方法用于海底沉積物樣品中PCBs的分析檢測(cè)，回收率均在81％-115%的范圍內(nèi)，變異系數(shù)（CV）均小于15%。
　　（3）將抗體進(jìn)行生物素化預(yù)處理，利用生物素-親和素生物系統(tǒng)，分別建立了檢測(cè)PCB12、PCB37和PCB77的BA-ELISA方法。優(yōu)化了包被原及生物素化抗體濃度，SA

7、-HRP濃度，抗原抗體反應(yīng)時(shí)間，生物素化抗體與SA-HRP反應(yīng)時(shí)間等實(shí)驗(yàn)條件，同時(shí)還討論了有機(jī)溶劑濃度，反應(yīng)介質(zhì)中pH值及鹽離子濃度對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響；在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，分別建立了檢測(cè)PCB12、PCB37和PCB77的標(biāo)準(zhǔn)曲線；基于多克隆抗體，該方法檢測(cè)PCB12、PCB37和PCB77的IC50分別為0.53μg L-1，0.68μg L-1，1.36μg L-1；LOD分別為4.5 ng L-1、17 ng L-1、18 ng L-1；

8、基于單克隆抗體，該方法檢測(cè)PCB37的IC50為0.27μg L-1，LOD8 ng L-1；將建立的方法用于帶魚(yú)樣品中 PCBs的分析檢測(cè)，加標(biāo)樣品中 PCB12、PCB37和PCB77的回收率均在81%-113%之間，CV均小于15%。
　　（4）分別用羊抗兔IgG、羊抗小鼠IgG及DNA修飾15 nm的GNPs，制備了羊抗兔IgG-GNPs-DNA和羊抗小鼠IgG-GNPs-DNA兩種GNPs探針，用紫外掃描光譜和透射電鏡（

9、TEM）對(duì)其表征，確定抗體和DNA修飾在GNPs表面。
　　基于這兩種GNPs探針，分別建立了檢測(cè)PCB12、PCB37、PCB77和Aroclor1248的基于rt-IPCR的間接BCA方法。該方法將包被原包被在戊二醛預(yù)處理過(guò)的 PCR管上，讓其和樣品中的目標(biāo)分子競(jìng)爭(zhēng)抗體，與包被原結(jié)合的抗體保留在PCR管內(nèi)，然后通過(guò)抗體與GNPs探針表面的二抗結(jié)合，使得部分GNPs探針附著在PCR管內(nèi)，其他GNPs探針則通過(guò)洗滌去除，在實(shí)時(shí)熒光

10、定量PCR擴(kuò)增階段，條形碼DNA從GNPs探針表面釋放到PCR管內(nèi)，并作為模板DNA直接參與PCR擴(kuò)增，通過(guò)測(cè)定條形碼DNA的量來(lái)間接檢測(cè)樣品中PCBs的含量。
　　優(yōu)化了退火溫度，引物濃度，抗原抗體濃度，封閉液，GNPs探針濃度，抗體與 GNPs探針?lè)磻?yīng)時(shí)間等實(shí)驗(yàn)條件；在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，基于羊抗兔 IgG-GNPs-DNA探針和抗PCB12、抗PCB37、抗PCB77、抗Aroclor1248四種多克隆抗體，分別建立了檢測(cè)PCB

11、12、PCB37、PCB77、Aroclor1248的標(biāo)準(zhǔn)曲線，其檢測(cè)下限分別為2.63 pg L-1，4.35 pg L-1，1.72 pg L-1，10.20 pg L-1?；谘蚩剐∈驣gG-GNPs-DNA探針和抗PCB37單克隆抗體，該方法檢測(cè)PCB37的LOD為2.03 pg L-1。將建立的方法用于小黃魚(yú)樣品中PCBs的分析檢測(cè)，加標(biāo)樣品的回收率均在81%-112%之間，CV均小于15%。
　?。?）分別用不同的抗體

12、和DNA修飾15 nm的GNPs，制備了五種GNPs探針，抗PCB12抗體-GNPs-DNA，抗PCB37多抗-GNPs-DNA，抗PCB37單抗-GNPs-DNA，抗PCB77抗體-GNPs-DNA和抗Aroclor1248抗體-GNPs-DNA，分別用紫外掃描光譜和TEM對(duì)其表征，確保抗體和DNA修飾在GNPs表面；
　　基于這五種GNPs探針，分別建立了檢測(cè)PCB12、PCB37、PCB77和Aroclor1248的基于rt

13、-IPCR的直接競(jìng)爭(zhēng)BCA方法。該方法將包被原包被在戊二醛預(yù)處理過(guò)的PCR管上，讓其和樣品中的目標(biāo)分子競(jìng)爭(zhēng)GNPs探針上的抗體，一部分GNPs通過(guò)包被原與抗體的特異性結(jié)合附著在PCR管內(nèi)，其他GNPs探針則通過(guò)洗滌去除，在實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增階段，條形碼DNA從GNPs探針表面釋放PCR管內(nèi)，并作為模板DNA直接參與PCR擴(kuò)增，通過(guò)測(cè)定條形碼DNA的量來(lái)間接檢測(cè)樣品中PCBs的含量。
　　優(yōu)化了金納米探針濃度，封閉液，抗原抗體反

14、應(yīng)時(shí)間，有機(jī)溶劑濃度，反應(yīng)介質(zhì)中鹽離子強(qiáng)度，pH值等條件，并在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，分別建立了檢測(cè)不同目標(biāo)分子的標(biāo)準(zhǔn)曲線。該方法檢測(cè)PCB12、PCB77、Aroclor1248的檢測(cè)下限分別為4.36 pg L-1，9.12 pg L-1，2.55 pg L-1；基于多克隆抗體和單克隆抗體，該方法檢測(cè)PCB37的檢測(cè)下限分別為4.64 pg L-1，3.15 pg L-1；將建立的方法用于帶魚(yú)樣品中PCBs的分析檢測(cè)，加標(biāo)樣品回收率均在81