釀酒酵母CK2的結(jié)構(gòu)與功能研究.pdf

1、CK2是一種保守的蛋白激酶，它廣泛分布于真核生物中，通過磷酸化蛋白底物的絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸在很多生物學(xué)過程中發(fā)揮作用。CK2不同于其它蛋白激酶之處在于它具有組成型活性，并且既可以利用ATP又可以利用GTP作為磷酰基供體。CK2是一個(gè)多亞基復(fù)合物，它包括α-亞基（催化亞基）和β-亞基（調(diào)節(jié)亞基），前者包含蛋白激酶的催化結(jié)構(gòu)域。
　　我們解析了重組scCK2α與不同核苷酸輔底物（GMPPNP，ATP和AMPPN）與金屬離子(Mg2

2、+或Mn2+)的晶體結(jié)構(gòu)。scCK2α的整體結(jié)構(gòu)和同源蛋白相似，包括兩個(gè)結(jié)構(gòu)域及兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間的輔底物結(jié)合位點(diǎn)。然而，scCK2α的晶體結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出與其同源蛋白不同的三個(gè)特征。首先，scCK2α在序列上的獨(dú)特之處在于它包含了一段38個(gè)殘基的插入序列，功能目前尚不清楚。根據(jù)結(jié)構(gòu)分析并結(jié)合之前的研究，我們推測(cè)它可能參與保持其活性中心的開放構(gòu)象，同時(shí)它并不參與和兩個(gè)調(diào)節(jié)亞基的結(jié)合。其次，scCK2α中的兩對(duì)殘基Lys45-Glu53和Arg48

3、-Glu53的相互作用使得Lys50采取了一種特殊的構(gòu)象，使其可以直接固定輔底物的γ-磷酸基團(tuán)，這樣就使得“必需二價(jià)陽離子”顯得不那么必需。我們推斷scCK2α可能存在多種“核苷酸-二價(jià)陽離子”結(jié)合方式，這明顯不同于在活性中心有兩個(gè)二價(jià)陽離子結(jié)合的zmCK2α或hCK2α。最后，scCK2α-AMPPN結(jié)構(gòu)中Glu53的構(gòu)象變化破壞了它與Lys5和Arg48的結(jié)合，使得輔底物結(jié)合口袋變大。這種構(gòu)象變化暗示了一個(gè)關(guān)于ADP/GDP釋放的路

4、徑，因?yàn)樵贑K2α中，催化三聯(lián)體由“DFG”變成了“DWG”，其中的Trp的NE1原子與Leu212的O原子形成氫鍵，這就使得由原來的“DFG翻轉(zhuǎn)”促成ADP的釋放變得不太可能。巧合的是，在輔底物結(jié)合部位我們觀察到了兩個(gè)殘基Arg161和Lys197捕捉到了兩個(gè)SO42-離子，對(duì)這兩個(gè)殘基進(jìn)行突變，突變體結(jié)合和利用ATP/GTP的效率都大大降低，這與我們關(guān)于潛在的釋放路徑的推測(cè)相符。
　　雖然CK2各亞基間的親和力很高，但是目前的

5、研究表明CK2只是一個(gè)結(jié)合較強(qiáng)的瞬時(shí)復(fù)合物，各個(gè)亞基在細(xì)胞內(nèi)也是獨(dú)立運(yùn)動(dòng)的。hCK2的全酶形式α2β2的晶體結(jié)構(gòu)表明，兩個(gè)β-亞基形成一個(gè)同二聚體，兩個(gè)α-亞基各自結(jié)合在它的兩側(cè)形成一個(gè)“蝴蝶”形狀。我們的實(shí)驗(yàn)表明，釀酒酵母CK2的四個(gè)亞基相互作用方式似乎與hCK2不同，而且核苷酸與催化亞基scCK2α的結(jié)合可能會(huì)調(diào)節(jié)它與β-亞基的結(jié)合。目前僅知道CK2β和CK2β對(duì)于組裝成全酶必不可少，也不可替代，但具體組裝方式還有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

6、。
　　CK2不僅能做為一個(gè)全酶存在并發(fā)揮功能，其亞基還可與其它蛋白質(zhì)組裝成不同的復(fù)合物，只不過相比之下CK2亞基間的結(jié)合更強(qiáng)。當(dāng)細(xì)胞被紫外線照射受損時(shí)，hFACT可以結(jié)合到hCK2上，改變后者的構(gòu)象和底物特異性，使其在細(xì)胞內(nèi)特異地磷酸化p53的Ser392，從而穩(wěn)定p53的四聚體結(jié)構(gòu)以重啟基因轉(zhuǎn)錄或復(fù)制。在釀酒酵母中，有報(bào)道指出CK2可能是通過CHD1間接地與Spt16-Pob3結(jié)合，也有報(bào)道提到CK2可以和Spt16-Pob3

7、直接結(jié)合，但是并沒有給出直接的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。
　　FACT在轉(zhuǎn)錄和復(fù)制過程中都發(fā)揮了重要的作用，人源FACT(hFACT)包括Spt16和SSRP1兩個(gè)亞基，但是在釀酒酵母中FACT(yFACT)卻包含三個(gè)亞基:Spt16，Pob3，以及一個(gè)類HMG1蛋白——Nhp6A/Nhp6B。人源Spt16和酵母Spt16同源，具有相似的長(zhǎng)度，Pob3缺少相對(duì)于SSRP1的C端部分，后者包含一個(gè)HMG1結(jié)構(gòu)域。我們克隆并純化了scCK2的四個(gè)亞