Saccharomyces cerevisiae OYE2分子改造及其在不對稱合成(R)-香茅醛中的應用.pdf

1、(R）-香茅醛可作為治療乳腺癌的藥物，也是用于L-薄荷醇合成的重要手性間體。(R）-香茅醛的合成包括化學法和生物酶法。生物酶法不對稱氫化檸檬醛合成(R）-香茅醛的關鍵酶是烯醇還原酶，該酶催化順反異構(gòu)體混合物的加氫，其產(chǎn)物的手性往往是互補的，因此產(chǎn)物e.e.值往往很低。為了提高烯醇還原酶在不對稱氫化反應中的產(chǎn)物e.e.值，本文基于源自Saccharomyces cerevisiae的烯醇還原酶OYE2作了如下工作:(1)OYE2催化的不對

2、稱氫化偶聯(lián)氨基酸催化的異構(gòu)化反應的體系構(gòu)建與優(yōu)化;(2)基于理性設計改造OYE2從而改善其立體選擇性;(3)利用熒光法篩選烯醇還原酶的初步探索。
　　為了考察底物與產(chǎn)物轉(zhuǎn)化的對應關系，OYE2分別以(E)-、(Z)-或(E/Z)-檸檬醛檸檬醛為底物進行不對稱氫化反應。經(jīng)11h反應后，(Z)-檸檬醛中16.97％轉(zhuǎn)化為(R）-香茅醛，83.03％轉(zhuǎn)化為（S)-香茅醛;(E)-檸檬醛中94.85％轉(zhuǎn)化為(R）-香茅醛，5.15％轉(zhuǎn)化為

3、（S)-香茅醛。在反應體系構(gòu)建中，通過添加甲酸脫氫酶及甲酸鈉實現(xiàn)輔酶循環(huán)，并通過不對稱氫化偶聯(lián)氨基酸催化的異構(gòu)化反應提高產(chǎn)物e.e.值。優(yōu)化后的最優(yōu)體系包括:最適氨基酸為甘氨酸，濃度為1M，pH為7.0。添加1M甘氨酸后，（E/Z）-檸檬醛反應產(chǎn)物的得率和e.e.值分別為91.84％和75.06％，比對照組（不添加甘氨酸）分別提高了23.90％和27.62％。
　　通過對烯醇還原酶OYE2的理性設計提高其立體選擇性。經(jīng)同源建模、分

4、子對接及結(jié)構(gòu)分析，推測底物結(jié)合口袋附近的氨基酸殘基(如Met39，Pro75，Trp116，Thr196和Phe296)在底物識別中起重要作用。從構(gòu)建的突變子庫中篩選獲得了立體選擇性提高了的突變子P75M。將其與順、反檸檬醛分別進行不對稱氫化反應，經(jīng)11h反應后，(Z)-檸檬醛轉(zhuǎn)化為(R）-香茅醛的比例較OYE2提高了23.11％;以(E/Z)-檸檬醛為底物時，(R）-香茅醛e.e.值較OYE2提高了19.38％。添加1M甘氨酸后，反應

5、的(R）-香茅醛的e.e.值比OYE2偶聯(lián)甘氨酸反應所得值提高了12.66％。結(jié)構(gòu)分析表明P75M的突變使(Z)-檸檬醛α，β-不飽和鍵的π系統(tǒng)的相對面更容易獲取氫，從而有利于(R）-香茅醛的形成。
　　此外，初步建立了利用熒光法篩選烯醇還原酶的流程。在該篩選流程中，異煙肼(INH)在甲醇的鋁鹽溶液中與檸檬醛的α，β-不飽和鍵反應形成絡合物而產(chǎn)生熒光。該物質(zhì)在激發(fā)波長Ex=400nm及發(fā)射波長Em=510nm下熒光信號最強，而且熒