聚合物-非離子表面活性劑雙水相體系機(jī)理及膜蛋白分配研究.pdf

1、新型聚合物/非離子表面活性劑雙水相體系不但具有非離子型表面活性劑雙水相體系膠團(tuán)的特點(diǎn),同時(shí)具有傳統(tǒng)聚合物/聚合物雙水相體系的優(yōu)勢(shì)。本文重點(diǎn)研究聚合物/非離子表面活性劑雙水相體系的成相機(jī)制,以PEG/TritonX-100和PEG/Tween80雙水相體系為代表,對(duì)聚合物/非離子表面活性劑雙水相體系成相特性規(guī)律進(jìn)行研究,以及對(duì)內(nèi)在膜蛋白的實(shí)際分配能力考察。開(kāi)展表面活性劑/聚合物雙水相富集分離內(nèi)在膜蛋白的研究,對(duì)拓展表面活性劑雙水相體系分離

2、純化應(yīng)用、推動(dòng)內(nèi)在膜蛋白分離、分析的研究進(jìn)程以及膜蛋白質(zhì)組學(xué)研究具有重要的意義。本文主要研究結(jié)果如下:
　　1.增加雙水相體系的溫度能夠擴(kuò)大成相區(qū)域。在0℃、20℃及40℃條件下,PEG20000/TritonX-100和PEG20000/Tween80成相區(qū)域隨溫度增加而增大,但Tween80對(duì)溫度的敏感性不如TritonX-100。雙水相體系成相區(qū)域隨PEG分子量增大而增大。添加NaCl可以增加雙水相體系的成相區(qū)域,而添加陰、

3、陽(yáng)離子表面活性劑則影響不大。下相非離子表面活性劑富集濃度大于上相聚合物富集濃度。
　　2.親水性氨基酸Arg等分配在聚合物相,疏水性氨基酸Trp分配在非離子表面活性劑相。系線長(zhǎng)度對(duì)氨基酸的分配有明顯的影響,親水性氨基酸的K隨著系線的增加增大,疏水性氨基酸的K則減小。非離子表面活性劑相的疏水性大于聚合物富集相,通過(guò)對(duì)溶菌酶表面氨基酸殘基分配系數(shù)的lnK與文獻(xiàn)報(bào)道的氨基酸相對(duì)疏水性(RH)的線性關(guān)系得出PEG/TritonX-100和

4、PEG/Tween80ATPS的疏水性因子(HF)的數(shù)量級(jí)為-10-2mol/KJ,表明下相TritonX-100及Tween80富集相比上相PEG富集相有更大的疏水性。蛋白表面氨基酸殘基對(duì)蛋白在雙水相體系中的分配起重要作用,通過(guò)溶菌酶表面氨基酸殘基預(yù)測(cè)的溶菌酶分配系數(shù)(K)與實(shí)驗(yàn)K一致。非離子表面活性劑相能夠富集高達(dá)99％的水不溶性生物分子。水不溶性膽固醇在PEG/TritonX-100和PEG/Tween80ATPS的K小于0.1,

5、并且隨系線長(zhǎng)度和PEG分子量的增加而減小。
　　3.親水性蛋白富集在聚合物相,而疏水性膜蛋白富集在非離子表面活性劑相。親水性低分子量牛血清白蛋白、溶菌酶、細(xì)胞色素C和α-乳白蛋白富集在PEG相,大分子量IgG和疏水性膜蛋白膽固醇氧化酶分配在TritonX-100膠團(tuán)相,增加系線長(zhǎng)度使雙水相固有疏水性增加,膽固醇氧化酶的K減小。富集在PEG相的溶菌酶比活力有所減小,而分配在TritonX-100相的溶菌酶比活力有所提高,分配在Tri

6、tonX-100膠團(tuán)相的IgG效價(jià)也有增大。說(shuō)明非離子表面活性劑膠團(tuán)具有穩(wěn)定蛋白活性的作用。鹽離子改變蛋白在雙水相體系的分配系數(shù),加入SDS或NaClO4引入相間電位能夠增加BSA的K,減小溶菌酶的分配系數(shù)。
　　4.通過(guò)生長(zhǎng)曲線,鹽生鹽桿菌第四天達(dá)到穩(wěn)定期,OD600為2.0。對(duì)細(xì)胞破碎上清液加入PEG20000/TritonX-100ATPS分配,通過(guò)LC-MS/MS質(zhì)譜鑒定,TritonX-100相富集PfkB域蛋白,β-內(nèi)