長(zhǎng)江流域棉紅鈴蟲鈣粘蛋白抗性等位基因的鑒定及分析.pdf

1、紅鈴蟲Pectinophora gassypiella是世界上最重要的棉花害蟲之一，曾經(jīng)長(zhǎng)時(shí)間在我國(guó)長(zhǎng)江流域棉區(qū)造成嚴(yán)重危害。自該區(qū)域種植轉(zhuǎn)Bt基因棉花（以下簡(jiǎn)稱Bt棉）以來(lái)，紅鈴蟲群得到了有效控制。然而，隨著Bt棉種植比例的不斷上升，已經(jīng)檢測(cè)到該區(qū)域田間紅鈴蟲種群對(duì)Cry1Ac的敏感性下降。為了尋找有效抑制紅鈴蟲對(duì)Bt棉抗性發(fā)展的方法，本文從長(zhǎng)江流域棉區(qū)采集紅鈴蟲田間個(gè)體，將其與室內(nèi)抗性個(gè)體進(jìn)行單對(duì)配對(duì)，從中篩選并純化出了多個(gè)紅鈴蟲C

2、ry1Ac抗性品系;通過(guò)分子生物學(xué)手段，明確了這些品系對(duì)Cry1Ac蛋白的抗性機(jī)理及其遺傳規(guī)律，建立了相應(yīng)的抗性基因分子檢測(cè)方法。主要結(jié)果如下:
　　1)從田間篩選并純化了4個(gè)紅鈴蟲Cry1Ac抗性品系，分別為AQ65、AQ47、AQ189與JL88，這4個(gè)品系對(duì)Cry1Ac原毒素蛋白的抗性倍數(shù)分別為:304、220、254與289倍，并且均為常染色體偏隱性遺傳;其中AQ65、AQ47與AQ189品系對(duì)Cry2Ab有低水平的交互抗

3、性（分別為2.60、2.09與1.82倍），而JL88品系對(duì)Cry2Ab沒(méi)有交互抗性。
　　2)這4個(gè)抗性品系均是PgCad發(fā)生突變且該突變與Cry1Ac抗性完全連鎖。與敏感紅鈴蟲gCad相比，PgCad189與gCad88的基因組DNA分別插入了一個(gè)234 bp與3370 bp的片段，PgCad47缺失了一個(gè)314 bp的片段，而PgCad65則既缺失了549 bp又插入了198 bp。
　　3)針對(duì)4個(gè)抗性品系PgCad

4、的突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)了8對(duì)特異性引物，用于檢測(cè)4種抗性等位基因及其基因型。2012-2015年長(zhǎng)江流域紅鈴蟲的抗性基因頻率檢測(cè)結(jié)果表明:PgCad47、PgCad189與PgCad88在田間的平均頻率分別為0.0003、0.0002與0.0003，并且4年間沒(méi)有顯著性差異。
　　4)所有品系均能在常規(guī)棉棉鈴上完成生活史;4個(gè)抗性品系亦能在轉(zhuǎn)Cry1Ac棉棉鈴上完成生活史，但其存活率低于常規(guī)棉棉鈴并且發(fā)育歷期顯著延長(zhǎng)、蛹重顯著降低;而敏感

5、品系則不能在轉(zhuǎn)Cry1Ac棉棉鈴上完成生活史。
　　5)將紅鈴蟲PgCad基因與GFP基因構(gòu)建表達(dá)載體，在TnH5昆蟲細(xì)胞中表達(dá)融合蛋白并定位:表達(dá)敏感紅鈴蟲PgCad-GFP的TnH5細(xì)胞對(duì)Cry1Ac活化蛋白的半效應(yīng)濃度(EC50)為6.79μg/ml，表達(dá)抗性紅鈴蟲鈣粘蛋白的TnH5細(xì)胞EC50均大于40μg/ml;敏感紅鈴蟲的PgCad-GFP主要定位在細(xì)胞膜上，而對(duì)于抗性紅鈴蟲，除了PgCad88A-GFP能定位到細(xì)胞膜

6、上外，PgCad47-GFP、PgCad65-GFP滯留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，PgCad189-GFP主要定位在囊泡上。
　　6)紅鈴蟲成蟲飼喂Cry1Ac實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:與對(duì)照組相比，飼喂10、40與160μg/ml Cry1Ac蛋白的抗、感品系產(chǎn)卵期均顯著縮短、產(chǎn)卵量顯著下降，但成蟲壽命、產(chǎn)卵率、產(chǎn)卵前期與卵孵化率沒(méi)有差異。當(dāng)蜂蜜水中的Cry1Ac蛋白提高到160與640μg/ml Cry1Ac時(shí)，與對(duì)照組相比，抗、感品系的成蟲壽命均顯著