春雷霉素生物合成調(diào)控及高產(chǎn)菌株改造.pdf

1、春雷霉素是由春雷鏈霉菌（Streptomyces kasugaensis）產(chǎn)生的一種重要的氨基糖苷類(lèi)抗生素，能與細(xì)菌核糖體30S小亞基結(jié)合，通過(guò)有效抑制蛋白合成的肽鏈延長(zhǎng)來(lái)發(fā)揮殺菌功能，因而作為高效廣譜低毒的生物農(nóng)藥被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)病害防治。春雷霉素生物合成基因簇于2006年被報(bào)道，但迄今為止其生物合成和調(diào)控機(jī)制的研究十分有限。本研究在春雷霉素生物合成基因簇的左翼序列鑒定了五個(gè)與春雷霉素生物合成調(diào)控相關(guān)的基因：途徑特異性正轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子

2、kasT，雙組份調(diào)控系統(tǒng)kasW/kasX，MerR家族負(fù)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子kasV和推測(cè)編碼異戊烯半胱氨酸羧甲基轉(zhuǎn)移酶的基因kasS。
　　KasT蛋白與鏈霉素生物合成的途徑特異性轉(zhuǎn)錄因子StrR高度同源，前期研究顯示KasT可以結(jié)合春雷霉素生物合成基因的啟動(dòng)子區(qū)。我們首次建立了春雷鏈霉菌BCRC12349（Streptomyces kasugaensis BCRC12349，LY）的遺傳操作系統(tǒng)，成功敲除了 kasT。kasT缺失后

3、春雷霉素不再產(chǎn)生，春雷霉素合成基因的表達(dá)量劇烈下降，kasT回補(bǔ)后春雷霉素恢復(fù)產(chǎn)生，而kasT加倍后可以將低產(chǎn)菌株LY中的春雷霉素產(chǎn)量提高3倍。這是第一次通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明了kasT是春雷霉素生物合成的途徑特異性正調(diào)控因子。
　　KasW和KasX分別與雙組份調(diào)控系統(tǒng)LuxR家族的應(yīng)答蛋白和組氨酸激酶具有很高的同源性。我們通過(guò)基因敲除和轉(zhuǎn)錄分析鑒定了kasW和kasX的功能。kasW、kasX缺失突變株中春雷霉素的產(chǎn)量分別提高了12

4、%和19%，qRT-PCR結(jié)果顯示，突變株中春雷霉素生物合成基因表達(dá)量均顯著提高，說(shuō)明kasW/X是春雷霉素生物合成的負(fù)調(diào)控基因；KasV蛋白與MerR家族轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子同源性較高，kasV突變使春雷霉素產(chǎn)量提高194%，生物合成相關(guān)基因的表達(dá)量提高4-8倍，表明kasV是春雷霉素生物合成的關(guān)鍵負(fù)調(diào)控基因；kasS與kasV位于同一個(gè)轉(zhuǎn)錄單元，KasS與異戊烯半胱氨酸羧甲基轉(zhuǎn)移酶具有較高的同源性。通過(guò)基因敲除和轉(zhuǎn)錄分析，我們發(fā)現(xiàn)kasS缺

5、失使春雷霉素的產(chǎn)量提高22%，春雷霉素生物合成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平提高3-9倍，說(shuō)明 kasS與春雷霉素生物合成調(diào)控間接負(fù)相關(guān)。因此，我們證明在低產(chǎn)菌株LY中敲除負(fù)調(diào)控基因kasW/kasX/kasV/kasS或加倍表達(dá)正調(diào)控基因kasT，可以有效地提高春雷霉素的產(chǎn)量。
　　基于在低產(chǎn)菌株中成功的產(chǎn)量提高策略，我們嘗試對(duì)高產(chǎn)的春雷霉素產(chǎn)生菌小金色鏈霉菌XM301（Streptomyces microaureus XM301，HY）進(jìn)

6、行基因工程改造。高產(chǎn)菌株HY的春雷霉素產(chǎn)量是低產(chǎn)菌株LY的10倍以上。初步的基因組序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)二者基因組具有高度相似性，而且春雷霉素生物合成基因簇序列完全相同。在高產(chǎn)菌株HY中敲除kasW/kasX，春雷霉素產(chǎn)量提高了58%，但是高表達(dá)kasT并未導(dǎo)致春雷霉素產(chǎn)量的明顯變化；kasV的缺失突變株中春雷霉素生物合成基因的表達(dá)量提高了4-8倍，但是產(chǎn)量并沒(méi)有明顯變化；kasS突變株的春雷霉素產(chǎn)量下降了43%，春雷霉素生物合成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水

7、平明顯降低，這與低產(chǎn)菌株中kasS的調(diào)控功能相反。
　　為了尋找低產(chǎn)菌株和高產(chǎn)菌株調(diào)控功能差異的原因，我們進(jìn)行了高產(chǎn)菌株HY和低產(chǎn)菌株LY的全基因組測(cè)序和轉(zhuǎn)錄組測(cè)定。轉(zhuǎn)錄組分析顯示，高產(chǎn)菌株HY中的春雷霉素生物合成基因表達(dá)量是低產(chǎn)菌株LY的40-80倍，暗示高產(chǎn)菌株中春雷霉素生物合成基因的轉(zhuǎn)錄已經(jīng)處于一個(gè)較高的水平，繼續(xù)提高其轉(zhuǎn)錄具有一定局限性，應(yīng)該考慮其他的春雷霉素生物合成相關(guān)因子并加以改造。
　　綜上所述，本研究在春雷霉