基于二硫化鉬的熒光生物傳感器在核酸分析中的應用研究.pdf

1、遺傳信息以特定核苷酸序列的形式貯存在核酸分子中，對核酸分子的序列、結構及含量的分析在醫(yī)學領域中有重要的應用價值，如疾病早期預防、腫瘤早期診斷、各種相關疾病診斷、療效監(jiān)測以及個體化治療等。特定序列的核酸分子能夠識別目標分子或催化某些反應，基于核酸的特異識別作用從而設計和發(fā)展各種快速簡單的核酸分析方法一直以來都是分子診斷技術方面關注的熱點。
　　傳統(tǒng)的核酸分析方法包括毛細管電泳法、變性高效液相色譜法、DNA微陣列法、變性梯度凝膠電泳法

2、和溫度梯度凝膠電泳法等，這些方法大都是在 PCR的基礎上實現(xiàn)核酸分析。然而這些傳統(tǒng)的核酸分析方法存在以下主要缺陷：需要較多較純的 PCR產物、實驗成本高、實驗步驟繁瑣以及耗時等。近年來，一些新型核酸分析方法克服了傳統(tǒng)方法的不足，其中， DNA生物傳感器因其實驗成本較低、靈敏度高、特異性好等優(yōu)勢在核酸分析領域得到快速發(fā)展。與其他DNA生物傳感器相比，熒光DNA生物傳感器在核酸分析診斷中應用較廣泛，因為該傳感器有其獨特的優(yōu)勢，比如樣品前處理

3、容易、實驗操作簡單、響應迅速、易與其他方法聯(lián)用以及無需參比器件等。在熒光傳感技術中，熒光探針發(fā)揮著重要的作用，而傳統(tǒng)熒光探針在應用于生物傳感等研究時，聚集誘導猝滅（ACQ）現(xiàn)象是其研究發(fā)展中最大的阻礙。
　　20世紀80年代末90年代初，納米技術逐步應用于生物傳感器領域，并已取得了突破性的進展，其中納米材料的應用是納米生物傳感技術領域最具活力、最有潛力、最有研究價值的一個分支。隨著2004年英國兩位科學家Konstantin No

4、voselon和Andre K. Geim發(fā)現(xiàn)了石墨烯，使類石墨烯二維納米材料，尤其是過渡金屬二硫化物納米材料(Transition metal dichalcogenides，TMDs）在生物傳感技術中的應用逐步被重視。相對于石墨烯，TMDs可以很容易地大規(guī)模合成并直接分散在水溶液中，而無需表面活性劑或氧化等額外復雜的處理。除此之外，TMDs因其優(yōu)良的猝滅能力在熒光納米生物傳感領域中非常有前景，而二硫化鉬又是 TMDs最典型且常用的代

5、表材料。
　　本工作中，將二硫化鉬納米片與熒光探針相結合，利用MoS2其較高的猝滅能力和能有效的區(qū)分ss-DNA和ds-DNA的特性，以及后來對熒光探針的改良，致力于提高檢測靈敏度和特異性等，發(fā)展了一系列分別以DNA甲基化和 DNA為檢測對象的簡單快速核酸分析的熒光生物傳感技術。具體研究內容分別如下：
　　(1)基于二硫化鉬熒光生物傳感器用于DNA甲基化的快速分析
　　DNA甲基化是一種重要的腫瘤標志物，建立一種簡單、

6、快速和靈敏的DNA甲基化分析方法較為重要。BstUI，是一種對人類5’-CGCG-3’位點敏感的限制性內切酶，然而當此位點發(fā)生半/全甲基化時其酶切功能喪失。設計以熒光素標記的DNA為探針，二硫化鉬納米片為熒光猝滅劑和傳感平臺，利用限制性內切酶BstUI特異性剪切能力，建立一種簡單的熒光傳感方法用于在勻相中對p16啟動子DNA甲基化快速分析。該傳感方法展現(xiàn)了不錯的靈敏度，可用于區(qū)分低至1％的甲基化水平級別的混合物。相比之前報道甲基化水平分

7、析，這種巧妙地免亞硫酸鹽處理的設計不僅可以避免 PCR的局限性，而且具有良好的特異性，靈敏度高，檢測時間短(3h)和操作方便等的優(yōu)點。
　　(2)基于聚集誘導發(fā)光探針和二硫化鉬的 DNA生物傳感器的初步研究
　　在以MoS2為檢測平臺的基礎上，對傳統(tǒng)熒光探針的改良是本章研究的重點。TPE分子的合成成本低廉，免標記的熒光探針能克服傳統(tǒng)熒光探針諸如ACQ現(xiàn)象、光漂白等問題。以四苯乙烯（TPE）衍生物與DNA相結合為免標記的熒光探

8、針，二硫化鉬納米片為熒光猝滅劑和傳感平臺，利用TPE的聚集誘導發(fā)光（AIE）效應建立一種免熒光標記的熒光核酸生物傳感器。TPE作為典型的 AIE分子，它在分散溶液中不發(fā)光或發(fā)微弱的光，但是當加入DNA時，則DNA和探針聚集形成復合物，發(fā)射很強的熒光信號。但是TPE對單鏈DNA和雙鏈DNA無任何選擇性。于是，可以通過二硫化鉬納米片的高熒光猝滅效率和對單、雙鏈核酸的選擇性吸附作用，從而實現(xiàn)免標記熒光核酸分析。由于本課題只是初步構建了基于TP