動力學液相色譜法.pdf

1、隨著生命科學的發(fā)展，眾多復雜生物樣品的分析、分離與純化為現(xiàn)代分離科學提出了許多熱點研究課題。色譜分離技術仍然是生物工程下游技術中的核心步驟，如何盡可能獲得良好分離效果是分離科學工作者追求的的一個重要目標之一。近年來出現(xiàn)了一類全新的色譜分離方法，其分離機理與傳統(tǒng)的基于熱力學理論的分離模式不同，溶質在動力學因素，如流動相流速、填料顆粒的型狀、大小的影響下具有不同的色譜保留特性，利用動力學因素對溶質進行分離，我們將其稱之為動力學色譜法。已有的

2、工作多集中在理論研究，實際應用多限于分離一些標準小分子和DNA分子片段，因此該方法有待進一步發(fā)展和開拓其用途。本文以反相液相色譜(RPLC)為載體，研究了溶質的動力學色譜規(guī)律，發(fā)現(xiàn)了溶質普遍遵循的動力學方程式，提出了兩個描述溶質動力學色譜行為的動力學參數(shù)，并將其用于實際樣品分離。論文包括以下六個部分： 1．文獻綜述：簡單地討論了色譜動力學的發(fā)展、基礎理論和主要內容，包括塔板理論、速率理論、非平衡理論和質量平衡理論四部分。闡述了動

3、力學色譜和色譜動力學的主要區(qū)別。重點綜述了兩種動力學色譜，即流體動力色譜和障礙色譜的分離原理、模型、儀器、應用和二者之間的異同點及聯(lián)系。共引用文獻75篇。 2．以細胞色素—c肽譜為研究對象，初步研究了反相液相色譜中動力學因素對其分離效果的影響。重點討論了流動相流速對分離度、峰容量和溶質洗脫順序的影響。同時研究了溶質分子量與溶質相對保留值之間的關系、發(fā)現(xiàn)溶質相對保留值與流速之間存在雙對數(shù)的線性關系log(RRT)=a+b log(

4、v)以及溶質分子量與方程式中二經(jīng)驗常數(shù)a值和b值之間的關系，并將該雙對數(shù)的線性關系方程式與SDT里的兩組線性方程式進行了比較。 3．探討了小分子、多肽和大分子蛋白質在反相液相色譜中的動力學色譜行為。提出了溶質普遍遵循的動力學色譜方程式，即log(RRT)=a+b log(v)。詳細地探討了該動力學色譜方程式中的兩參數(shù)a、b在分離中的的意義，即參數(shù)a的意義定義為在流動相流速為1.0ml/min時溶質的相對保留值的對數(shù)值，b值用來描

5、述溶質相對保留值隨流速變化的趨勢大小。由于a、b均是在動力學因素流速變化的條件下描述溶質保留情況的，因此，a、b是兩個與熱力學無關的動力學色譜參數(shù)。研究發(fā)現(xiàn)溶質的相對保留值與分量之間無特定關系，也不符合SC或HDC機理。a、b之間具有一定的線性關系，但其相關系數(shù)不是很好。 4．RPLC中溶質相對保留值和流動相流速之間存在雙對數(shù)線性關系，本章以Lys中4種較難分離的組分為研究目標，根據(jù)動力學色譜方程式中的兩參數(shù)a、b的意義，對該4

6、種組分的分離進行了動力學流速條件的優(yōu)化。由動力學色譜參數(shù)a，b值推測了溶質在不同流速時色譜圖中的分離情況，驗證了動力學參數(shù)a，b值所代表意義的合理性，并預測了分離的最佳流速。 5．溶質在RPLC中滿足動力學色譜方程式log(RRT)=a+6 log(v)，實驗證實小分子的動力學參數(shù)b值普遍地小于大分子蛋白質的b值，因此流動相流速對小分子相對保留值的影響趨勢大于大分子蛋白，小分子在色譜柱中比大分子蛋白遷移速度的快。本章?lián)颂岢隽藘?/p>

7、種分離復雜樣品的動力學色譜策略，即：a：在流速增大到一定程度時，小分子組分會和大分子組分在進行梯度洗脫時會快速分成兩大部分，簡化了分離程序。b：小分子洗脫濃度是一個范圍，而蛋白質大分子洗脫濃度很窄，可以認為是一個點，洗脫復雜樣品時，可以先進行一個適宜濃度的等度洗脫小分子，然后進行梯度洗脫大分子。采用上述兩種動力學色譜策略對蟾蜍卵子細胞組分進行了快速分離純化，并對高豐度多肽組分進行了去除，同時富集了低豐度蛋白組分。預計該動力學色譜策略將為