兩種核糖體肽類天然產物的生物合成機制研究.pdf

1、Pantocin A(PA)是由成團泛菌產生的一種能夠通過抑制L-組氨醇磷酸氨基轉移酶活性從而阻斷組氨酸的生物合成RiPPs類天然產物，因此具有良好的抗導致果樹等火葉病的致病菌解淀粉歐文氏菌活性(Erwinia amylovora)。在2003年國外課題組已經對PA的分子結構，生物合成基因簇和可能的生物合成機制進行相關報道，但PA生物合成的體外生化表征一直未見發(fā)表。鑒于PA分子獨特的分子結構及其重要的生物活性，本文擬對PA的生物合成關鍵

2、催化機制進行研究。我們從P. agglomerans基因組中成功克隆到參與PA分子生物合成的兩個關鍵基因paaA和paaB,隨后將paaA和paaB分別因克隆至pET28a表達載體，獲得表達質粒并分別轉化E.coli BL21進行蛋白誘導表達、親和純化。隨后將化學合成的前體肽PaaP作為反應底物，擬對PaaA和PaaB蛋白進行生物活性測試，與此同時國外研究組率先發(fā)表了PaaA在PA合成過程中通過Claisen縮合和脫羧形成雙環(huán)核心，鑒于

3、此，我們擬對PaaA/B蛋白的晶體結構進行解析，為深入揭示PaaA/B的催化機制奠定基礎。
　　Sactipeptide是由核糖體合成并經過翻譯后修飾的一類多肽類天然產物，可表現出多種生理活性，此類化合物特有的標志是在它們分子內部存在一組或多組由半胱氨酸的巰基與另一氨基酸α-碳原子受體形成硫醚鍵。目前報道的Sactipeptide天然產物多來自于好氧芽孢桿菌，但通過生物信息學分析，我們發(fā)現在某些厭氧菌如拜氏梭菌（C. beijer

4、inckii）中也發(fā)現了類似Sactipeptide生物合成基因簇。本課題中，我們將該基因簇中前體肽和修飾酶基因同時克隆至pRSFduet-1載體，并在在大腸桿菌中進行異源共表達，對表達宿主進行細胞裂解及親和純化，電泳檢測后質譜鑒定純化產物，檢測到與預期分子量6372.19相差6.68Dal，根據SacA的氨基酸序列，推測可能是前體肽SacA分子內的7個Cys形成3組分子內二硫鍵而導致分子量減少6Dal。最后對修飾后的肽類進行質譜檢測和