異喹啉生物堿與核酸結(jié)合的構(gòu)效關(guān)系及應(yīng)用研究.pdf

1、許多生物小分子的生理活性都與各種結(jié)構(gòu)的核酸分子的相互作用密切相關(guān)，探究小分子與核酸結(jié)合的構(gòu)效關(guān)系具有十分重要的生物意義。因此，本論文選用三鏈DNA、分子信標(biāo)及脫堿基位點(diǎn)DNA為研究對(duì)象。根據(jù)對(duì)不同結(jié)構(gòu)的異喹啉生物堿與核酸之間相互作用的研究，分別開(kāi)發(fā)了pH和金屬離子調(diào)控的分子開(kāi)關(guān)、靈敏度可調(diào)的免標(biāo)記分子信標(biāo)以及手性熒光傳感器。主要研究?jī)?nèi)容如下:
　　1.以異喹啉生物堿作為選擇劑、穩(wěn)定劑、誘導(dǎo)劑以及開(kāi)關(guān)信號(hào)的三鏈DNA熒光傳感

2、　　三鏈DNA逐漸在多個(gè)領(lǐng)域引起了人們的廣泛關(guān)注，諸如基因表達(dá)、藥物篩選、分子開(kāi)關(guān)以及傳感器等。然而，其應(yīng)用都取決于三鏈結(jié)構(gòu)的形成與穩(wěn)定。研究了多種結(jié)構(gòu)的異喹啉生物堿對(duì)三鏈DNA的識(shí)別，發(fā)現(xiàn)天然小分子白屈菜紅堿(CHE)對(duì)特異性識(shí)別三鏈結(jié)構(gòu)的選擇性最高，隨著三鏈DNA與CHE的結(jié)合，DNA的三鏈結(jié)構(gòu)部分穩(wěn)定性逐漸增強(qiáng)而雙鏈結(jié)構(gòu)部分的穩(wěn)定性沒(méi)有任何影響。CHE能夠誘導(dǎo)易形成三鏈的寡核苷酸鏈(TFO)與其對(duì)應(yīng)的雙鏈部分結(jié)合形成三鏈DNA。由

3、于CHE與三鏈結(jié)構(gòu)結(jié)合能夠使其熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，因此，CHE可以作為檢測(cè)三鏈結(jié)構(gòu)的有效分子探針。利用CHE作為特異性的選擇劑、誘導(dǎo)劑以及開(kāi)關(guān)信號(hào)，成功地設(shè)計(jì)了這種pH和金屬離子調(diào)控的免標(biāo)記三鏈納米開(kāi)關(guān)。
　　2.可調(diào)的免標(biāo)記三鏈分子信標(biāo)用于DNA分析
　　核酸序列的檢測(cè)在現(xiàn)代生命科學(xué)中占有十分重要的地位。分子信標(biāo)操作簡(jiǎn)單、反應(yīng)靈敏并且具有高度的選擇性，一直是人們的研究熱點(diǎn)。在此，由于三鏈DNA結(jié)構(gòu)對(duì)溶液pH較為敏感，設(shè)計(jì)了一

4、種靈敏度可調(diào)的免標(biāo)記tMB。由于天然小分子CHE能夠與三鏈結(jié)構(gòu)特異性結(jié)合并熒光增強(qiáng)，且能夠穩(wěn)定三鏈結(jié)構(gòu)并誘導(dǎo)其形成，選用了CHE作為開(kāi)關(guān)信號(hào)。不加入靶標(biāo)序列時(shí)，tMB莖部呈三鏈結(jié)構(gòu)與CHE結(jié)合，熒光信號(hào)響應(yīng);加入靶標(biāo)序列與環(huán)狀部分結(jié)合后，環(huán)狀部分形成剛性雙鏈結(jié)構(gòu)從而將莖部的三鏈體破壞，熒光信號(hào)明顯降低，而加入含有變異堿基(G/C)的靶標(biāo)序列，與環(huán)狀部分不能形成穩(wěn)定結(jié)構(gòu)而不能明顯破壞莖部的三鏈結(jié)構(gòu)，熒光信號(hào)基本不變。改變?nèi)芤簆H能使tMB

5、三鏈結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性也隨之發(fā)生變化，可以調(diào)控對(duì)序列檢測(cè)的靈敏度。
　　3.基于雙鏈DNA的手性熒光傳感器
　　運(yùn)用生物大分子對(duì)天然手性對(duì)映異構(gòu)體的快速識(shí)別有助于手性傳感器的發(fā)展以及加快藥物的開(kāi)發(fā)。在這項(xiàng)工作中，首次運(yùn)用含有AP位點(diǎn)的雙鏈DNA來(lái)探究其區(qū)分對(duì)映體的能力。選用一種能夠與AP位點(diǎn)特異性結(jié)合的熒光團(tuán)用作熒光探針，以天然的四氫巴馬汀(THP)為代表性對(duì)映體，開(kāi)發(fā)了一種可用于直接檢測(cè)的手性傳感器。發(fā)現(xiàn)，由于L-THP能夠特異

6、性與AP位點(diǎn)結(jié)合(L-THP的結(jié)合常數(shù)高出D-THP兩個(gè)數(shù)量級(jí))，因此只有L-THP能夠有效取代AP位點(diǎn)原本結(jié)合的熒光團(tuán)而使體系熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)。通過(guò)熒光滴定、等溫滴定量熱法以及DNA熔解實(shí)驗(yàn)確定L-THP與AP位點(diǎn)的結(jié)合強(qiáng)于D-THP，并且可以通過(guò)改變AP位點(diǎn)的數(shù)目以及其側(cè)翼序列調(diào)節(jié)該傳感器區(qū)分對(duì)映體的能力。對(duì)單個(gè)手性原子誘導(dǎo)的異構(gòu)體的區(qū)分，單個(gè)AP位點(diǎn)便能夠提供一個(gè)完美的結(jié)合空腔。這項(xiàng)工作基于雙鏈DNA開(kāi)發(fā)的手性熒光傳感器進(jìn)一步推動(dòng)