嗜熱鏈球菌CRISPR-Cas系統(tǒng)的分析及抗噬菌體機(jī)制的研究.pdf

1、隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的不斷發(fā)展，發(fā)酵乳制品在國內(nèi)市場(chǎng)的需求量逐年增加。然而，在發(fā)酵過程中乳酸菌有時(shí)會(huì)遭受噬菌體的侵染，導(dǎo)致發(fā)酵失敗。乳酸菌自身的噬菌體防御機(jī)制能夠抵抗噬菌體的侵染，其中CRISPR-Cas系統(tǒng)廣泛存在于細(xì)菌和古細(xì)菌中，能夠?yàn)槿樗峋挚谷茉葱允删w提供獲得性免疫。實(shí)驗(yàn)室自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的乳酸菌其抗噬菌體能力仍有待研究，本課題對(duì)乳酸菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的CRISPR-Cas系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和類型進(jìn)行了預(yù)測(cè)，并檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的嗜熱鏈球菌的CRIS

2、PR-Cas系統(tǒng)。篩選出3株嗜熱鏈球菌抗噬菌體突變菌株，分析了其抗噬菌體機(jī)制。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴基于生物信息學(xué)方法對(duì)NCBI中已測(cè)序嗜熱鏈球菌的CRISPR-Cas系統(tǒng)進(jìn)行預(yù)測(cè)，比較分析了瑞士乳桿菌及德氏乳桿菌保加利亞亞種的CRISPR-Cas系統(tǒng)以探究CRISPR-Cas系統(tǒng)在乳酸菌種間的同源性關(guān)系。結(jié)果表明盡管菌種不同，相同類型的CRISPR-Cas系統(tǒng)其重復(fù)序列高度保守，cas基因序列同源性較高，且重復(fù)序列與Cas

3、蛋白在一定程度上體現(xiàn)了共進(jìn)化的特點(diǎn)，這在一定程度上為CRISPR-Cas基因座能夠發(fā)生水平基因轉(zhuǎn)移事件提供了佐證。⑵根據(jù)嗜熱鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株cas基因序列的保守性設(shè)計(jì)內(nèi)部引物，擴(kuò)增并測(cè)序具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的6株嗜熱鏈球菌的標(biāo)記cos基因，以分析其所含CRISPR-Cas系統(tǒng)的類型。結(jié)果表明，6株嗜熱鏈球菌中，S4僅含1個(gè)Ⅱ-A型CRISPR-Cas系統(tǒng)，其它5株均含有2個(gè)Ⅱ-A型CRISPR-Cas系統(tǒng)和1個(gè)Ⅲ-A型CRISPR-Cas系統(tǒng)

4、，此外，79和KLDS3.0207均含有1個(gè)Ⅰ-E型CRISPR-Cas系統(tǒng)。⑶擴(kuò)增3株實(shí)驗(yàn)室自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的嗜熱鏈球菌的CRISPR序列，預(yù)測(cè)嗜熱鏈球菌CRISPR基因座的活性，構(gòu)建重復(fù)序列的系統(tǒng)發(fā)育樹，并對(duì)間隔序列進(jìn)行同源性分析。預(yù)測(cè)實(shí)驗(yàn)室3株嗜熱鏈球菌的原間隔序列，為探究其抗噬菌體機(jī)制奠定基礎(chǔ)。結(jié)果顯示嗜熱鏈球菌S0含有3個(gè)CRISPR基因座，嗜熱鏈球菌S4僅含1個(gè)CRISPR基因座，嗜熱鏈球菌79含有4個(gè)CRISPR基因座，CRI

5、SPR1基因座活性最高，CRISPR2基因座最不活躍。相同類型的CRISPR-Cas系統(tǒng)其重復(fù)序列高度保守，不同類型的CRISPR-Cas系統(tǒng)其重復(fù)序列存在較大差異。不同CRISPR的間隔序列在內(nèi)容及數(shù)目上高度可變，其原間隔序列絕大部分來源于噬菌體，少數(shù)來源于質(zhì)粒或染色體序列。⑷擴(kuò)增并測(cè)序宿主嗜熱鏈球菌St-Ⅰ的CRISPR序列，采用自然選育法篩選抗噬菌體Φ7p的突變菌株，并對(duì)突變菌株進(jìn)行CRISPR序列擴(kuò)增、測(cè)序。結(jié)果表明，3株突變菌

6、株中僅BIM1的CRISPR3獲得了1個(gè)新的間隔序列，其余兩株突變菌株均無新間隔序列插入，說明BIM1是通過CRISPR-Cas系統(tǒng)防御噬菌體的，而其它兩株突變菌株則是通過其它防御機(jī)制對(duì)抗噬菌體入侵。⑸測(cè)定在高噬菌體環(huán)境下突變菌株與敏感菌株的發(fā)酵性能，結(jié)果表明敏感菌株在高噬菌體環(huán)境下的產(chǎn)酸、產(chǎn)黏及增殖能力均顯著下降，凝乳時(shí)間明顯延長(zhǎng)，而抗性菌株的發(fā)酵性能基本無變化。由此得出抗性菌株具有遺傳穩(wěn)定性和發(fā)酵穩(wěn)定性。⑹基于嗜熱鏈球菌79與標(biāo)準(zhǔn)菌