發(fā)菜胞外多糖化學修飾及免疫活性研究.pdf

1、發(fā)菜（Nostoc flagelliforme）是一種生長在干旱或半干旱條件下的陸生藍藻。目前，發(fā)菜細胞高密度液體培養(yǎng)技術逐漸成熟。發(fā)菜細胞在液體培養(yǎng)的過程中會向培養(yǎng)液中分泌胞外多糖，研究發(fā)現這種多糖具有很多生物活性，如增強免疫、抗腫瘤、抗氧化、抗炎等。但是，對這種多糖進行分子修飾的研究還未見報道。本課題以液體培養(yǎng)發(fā)菜細胞的培養(yǎng)液為材料，對發(fā)菜胞外多糖進行提取純化，然后采用化學合成的方法對純化后的發(fā)菜胞外多糖進行硫酸化修飾和硒化修飾，研

2、究分子修飾前后多糖的體內免疫活性和體外免疫活性。
　　本研究主要內容包括：⑴采用抗生素法對發(fā)菜細胞進行純化，排除雜菌對試驗的影響。對純化后的發(fā)菜細胞進行擴培，以培養(yǎng)發(fā)菜細胞的培養(yǎng)液為材料提取發(fā)菜胞外多糖，并通過DEAE-52纖維素柱層析和凝膠柱層析對粗多糖進行純化。紫外光譜掃描純化后的發(fā)菜胞外多糖發(fā)現在260nm、280nm及520nm均沒有明顯的吸收峰，說明多糖中蛋白質的含量很少，且不含核酸和色素等雜質。⑵采用氯磺酸-吡啶法對發(fā)

3、菜胞外多糖進行硫酸化修飾，在單因素試驗的基礎上通過響應面優(yōu)化得到最佳反應條件為反應溫度71℃，反應時間3h，氯磺酸-吡啶的體積比為1:7。在這個條件下，取代度的值是5.05±0.032(N=3)。對分離純化的發(fā)菜胞外多糖和經硫酸化修飾的發(fā)菜胞外多糖分別進行紅外光譜檢測，硫酸酯化的多糖在1165cm-1和834cm-1處有兩個新的強烈的吸收峰分別代表不對稱的S=O和對稱振動的C-O-S鍵，表明硫酸根基團已經與多糖分子結合。⑶采用亞硒酸鈉法

4、對發(fā)菜胞外多糖進行硒化修飾，在單因素試驗的基礎上通過正交試驗設計得到最佳反應條件：發(fā)菜胞外多糖20mg，亞硒酸鈉20mg、氯化鋇20mg、反應溫度70℃、反應時間10h，在此條件下，得到的硒化發(fā)菜胞外多糖中硒的含量達到1.45mg/g，產率為64.20％。紅外光譜分析表明硒化多糖在875cm-1有一個弱的吸收峰，是亞硒酸酯的特征吸收峰，說明亞硒酸根已經和多糖結合。⑷研究硫酸化和硒化發(fā)菜胞外多糖對體內免疫活性的影響，結果表明多糖、硫酸化多

5、糖和硒化多糖在一定濃度范圍內均能提高小鼠的脾臟指數和胸腺指數；顯著提高小鼠碳粒廓清指數；增加小鼠的足趾厚度；提高小鼠抗體細胞的生成數及血清溶血素的含量，且呈現劑量關系，其中硫酸化修飾多糖的作用效果最顯著，說明對發(fā)菜多糖進行硫酸化修飾是提高多糖免疫活性的有效方法。⑸研究硫酸化和硒化發(fā)菜胞外多糖對體外免疫活性的影響，結果表明多糖、硫酸化多糖和硒化多糖的濃度從25μg/mL增加至100μg/mL時，脾淋巴細胞增殖指數逐漸增加、腹腔巨噬細胞吞噬