文心蘭OnAPl-like基因的克隆、表達分析及轉化體系的研究.pdf

1、文心蘭為蘭科(Orchidaceae)文心蘭屬（Oncidium）植物的總稱，又名舞女蘭、跳舞蘭，原產于中南美洲和北美洲南部。其花序分枝性良好，花色亮麗，花形優(yōu)美，具有良好的觀賞價值。近年來隨著分子生物學在花卉相關研究以及在育種過程中的應用，觀賞植物開花相關基因及其功能的研究成為當今研究的熱點，但是對文心蘭開花相關基因的研究還很少。本研究以文心蘭的花葶為材料，采用RT-PCR和RACE技術等方法，克隆出了文心蘭的開花相關基因OnAP1(

2、APETALA1)-like的保守序列及其全長序列開放閱讀框(ORF)的擴增，并對其進行了生物信息學分析;利用qRT-PCR技術分析該基因在不同時期不同器官的表達特性，并對文心蘭OnAP1-like基因進行了植物表達載體的構建;以及對文心蘭的遺傳轉化。主要研究結果如下:
　　1、文心蘭OnAP1-like基因cDNA全長序列的克隆及序列分析
　　以南茜文心蘭（Oncidium'GowerRamsey'）盛花期花葶提取的總RN

3、A為模板，通過RT-PCR與RACE擴增，獲得一個958bp的AP1(APETALA1)-like基因的cDNA全長序列，其基因編碼區(qū)690bp，共編碼氨基酸229個，命名為OnAP1-like（登錄號:KC426946）。蛋白質二級結構分析表明，該蛋白質48.91％為α螺旋，10.92％為β折疊，40.17％為無規(guī)則卷曲，為親水性蛋白質。蛋白序列比對和進化樹分析表明，OnAP1-like蛋白與蕙蘭AP1-like蛋白一致性最高，進化距

4、離最近。預測了該蛋白質的三維結構。
　　2、文心蘭OnAP1-like基因植物表達載體pR1101-OnAP1的構建
　　將克隆的OnAP1-like基因連接在pMD19-T上構建克隆載體pMD19-OnAP1。測序結果正確的pMD19-OnAP1和質粒pRI101ON經限制性內切酶XbaⅠ/SmaⅠ雙酶切后，經T4DNA連接酶連接后，構建成植物表達載體pRI101-OnAP1。經過菌落篩選、PCR檢測以及雙酶切驗證，最終確

5、定文心蘭OnAP1-like基因的植物表達載體pRI101-OnAP1構建成功，為遺傳轉化及雜交驗證打下基礎。
　　3、采用qRT-PCR技術對文心蘭OnAP1-like基因進行時空表達分析
　　利用RT-qPCR對從文心蘭不同時期不同器官中的OnAP1-like基因表達量進行分析，用2-ΔΔCt法來計算，結果表明，同一器官不同發(fā)育時期比較，在葉中，花蕾期的表達量最高;在根中，隨發(fā)育時間推移，表達量逐漸升高，至花后期達到最高