一步法復發(fā)及PEG修飾及其修飾產(chǎn)物的性能研究.pdf

1、目的:建立一種新型的工藝路線，將蛋白復性與蛋白PEG修飾整合為一步，即同步復性與修飾，從而一步從包涵體蛋白得到高修飾率、高特異性、高純度的PEG修飾蛋白，改善傳統(tǒng)蛋白復性與PEG化學修飾步驟繁瑣的缺陷。
　　方法:配制不同濃度的溶菌酶(20mM PB，pH7.0)溶液，RP-HPLC測定各溶液的洗脫峰。以溶菌酶濃度為橫坐標，洗脫峰面積為縱坐標，建立溶菌酶的標準曲線。精密稱取25mg溶菌酶加入到2.5ml的蛋白變性液中(20mM P

2、B，8M尿素，100mM DTT，pH7.0)使其終濃度為10 mg/mL，室溫放置4h待其變性。通過RP-HPLC確定其變性完全后用PD脫鹽柱將溶菌酶中的DTT脫除;變性后的溶菌酶加入到含PEG的復性緩沖液中(4 mM EDTA，1 mM GSSG，10 mM GSH，1.5 Murea，pH6.0，30mM NaBH3CN)，分別在2、4、8、12和24h取樣待測，取樣后加入2％甘氨酸終止反應。通過12％ SDS-PAGE與RP-H

3、PLC來摸索同步復性修飾的最佳反應條件并詳細分析同步復性修飾的具體過程。我們對影響蛋白復性與液相PEG修飾反應的2個主要參數(shù):即反應過程中緩沖液的pH值和反應時間進行了優(yōu)化。IEC（離子交換色譜）分析不同反應時間的同步復性與修飾產(chǎn)物，運用溶菌酶標準曲線與RP-HPLC分析同步復性與修飾過程中復性率和修飾率隨時間的變化，反應結束后用無鹽緩沖液將修飾蛋白混合液上樣到預先平衡的離子交換色譜柱(IEC)，上樣流速為0.5 mL/min，上樣結束

4、后用無鹽緩沖液沖下未與柱結合的雜質，然后分別用含0.2 M NaCl與1.0 M NaCl的緩沖液將未修飾的溶菌酶與修飾后的溶菌酶依次洗脫下來。運用MALDI-TOF質譜測定修飾產(chǎn)物的分子量;CD圓二色譜對比野生溶菌酶與PEG-LYS的二級結構是否存在差異;融壁微球菌檢測溶菌酶同步復性修飾后的活性變化。
　　結果:以溶菌酶為模型蛋白實施同步復性與修飾，SDS-PAGE結果說明一步法成功的對溶菌酶進行聚乙二醇修飾，通過RP-HPLC

5、證明了同步復性與修飾所得PEG修飾率與天然溶菌酶修飾率基本一致;采用IEC分析不同反應時間同步復性與修飾所得產(chǎn)物，結果表明在此過程中蛋白復性和蛋白PEG修飾同步完成。RP-HPLC對比分析野生型溶菌酶/復性溶菌酶/天然溶菌酶修飾和同步復性與修飾所得溶菌酶，結合溶菌酶標準曲線計算未修飾復性溶菌酶和修飾溶菌酶含量隨時間的變化，由RP-HPLC結合溶菌酶標準曲線作圖可以看出在反應進行8h之前，復性溶菌酶和PEG修飾溶菌酶的含量均隨著時間在增加

6、;反應時間超過8h后，PEG修飾溶菌酶含量依然升高，復性溶菌酶含量降低，這可能是由于蛋白復性接近飽和，先前累積的復性溶菌酶轉化為PEG修飾溶菌酶。結果證實同步復性與修飾方法在不影響其復性率的同時，確實同步完成了溶菌酶的復性以及其PEG修飾。MALDI-TOF質譜和圓二色譜對PEG-LYS進行結構表征，MALDI-TOF質譜的結果表明PEG-LYS的分子量為35754Da，提示只有一個PEG分子修飾到蛋白表面;CD結果顯示PEG-LYS與