酰胺水解基因proA的克隆表達、酶學(xué)特性研究及其應(yīng)用.pdf

1、本文以酰胺基因proA為對象，在對其酶學(xué)特性及降解功能驗證的基礎(chǔ)上進一步研究了其實際應(yīng)用。酰胺基因proA由之前實驗室從對乙酰氨基酚降解菌shinella sp.HZA2中克隆獲得。驗證結(jié)果表明proA的G+C含量為68.33％，編碼481-aa蛋白，分子量為50.066kDa，等電點為6.185。其編碼的蛋白酶屬于酰胺酶家族，與報道的其他酰胺酶顯示出較低的同源性(27-34％)。蛋白酶疏水性和酶結(jié)構(gòu)的預(yù)測對了解蛋白酶功能有重要的意義，

2、研究結(jié)果顯示該酰胺酶為親水性蛋白酶，堿基組成為204A，495C，493G，254T;百分比為14.1％A，34.2％C，34.1％G，17.6％T。通過對酰胺酶ProA的的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測可知該酶主要以α-螺旋，無規(guī)則卷曲和延伸鏈為主，進一步利用I-TASSER成功預(yù)測了ProA的空間結(jié)構(gòu)和酶活性位點。研究表明ProA的最佳反應(yīng)溫度為35℃，在25-45℃之間都有較強的活性。最適反應(yīng)pH值為8.0，在pH7.0-9.0范圍內(nèi)，該酶比較穩(wěn)定

3、;Cu2+、Ag+、Cd2+、Fe3+會強烈抑制酶的活性，而Mn2+、Ca2+、Al3+、Zn2+、Mg2+對該酶沒有明顯的抑制作用。
　　選取含酰胺鍵的酰胺類除草劑敵稗、敵草隆、吡嘧磺隆、炔苯酰草胺和吡氟酰草胺以及乙酰苯胺用于驗證ProA的功能。研究結(jié)果表明，proA編碼的蛋白酶可以高效水解敵稗分子中的酰胺鍵，以大腸桿菌作為受體菌合成的工程菌在兩個小時內(nèi)將敵稗完全降解，產(chǎn)物為3，4-二氯苯胺;蛋白酶ProA也可以使乙酰苯胺和敵草