shRNA沉默YAP表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞SMMC-7721增殖和凋亡的影響.pdf

1、Hippo信號(hào)通路在器官發(fā)展過(guò)程中主要通過(guò)的細(xì)胞增殖和凋亡控制器官大小。此信號(hào)通路在哺乳動(dòng)物體內(nèi)高度保守，在人類的癌癥發(fā)生過(guò)程中其通路的許多信號(hào)分子缺失并促進(jìn)了癌癥的發(fā)生，暗示其組件具有抑制腫瘤的作用。Yes相關(guān)蛋白(YAP)作為其下游負(fù)性調(diào)控最重要的轉(zhuǎn)錄共激活因子，Hippo信號(hào)通路失調(diào)，YAP磷酸化減少，活性增加進(jìn)入細(xì)胞核，促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制凋亡的相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄增加，從而參與了腫瘤的發(fā)生。
　　目的：本實(shí)驗(yàn)通過(guò)shRNA(sho

2、rthairpinRNA)抑制YAP基因的表達(dá)，并觀察其對(duì)肝癌細(xì)胞SMMC-7721的增殖、凋亡、周期及遷移能力的影響。
　　方法：以人YAPmRNA編碼區(qū)中的四條序列作為RNA干擾靶點(diǎn)，分別構(gòu)建四個(gè)真核表達(dá)載體質(zhì)粒shRNA-YAP-1、shRNA-YAP-2、shRNA-YAP-3、shRNA-YAP-4，用陽(yáng)離子聚合物瞬時(shí)轉(zhuǎn)染法，在293T細(xì)胞中篩出兩組干擾效果較好的質(zhì)粒，將它們分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞SMMC-7721。運(yùn)用實(shí)

3、時(shí)熒光定量PCR和Westernblot法檢測(cè)YAPmRNA和蛋白表達(dá)水平的變化；MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，并繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的改變；細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞遷移能力。
　　結(jié)果：運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Westernblot法檢測(cè)到肝癌細(xì)胞SMMC-7721中YAP的mRNA和蛋白表達(dá)水平較未轉(zhuǎn)染組均降低。MTT實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞劃痕模型顯示，shRNA-YAP-2、shRNA-YAP-4兩組細(xì)胞生長(zhǎng)明顯抑

4、制，細(xì)胞遷移減慢；流式細(xì)胞術(shù)顯示，轉(zhuǎn)染48h后，shRNA-YAP-2、shRNA-YAP-4轉(zhuǎn)染組SMMC-7721細(xì)胞凋亡數(shù)（12.01％±0.81、5.03%±1.01，P<0.05）明顯高于空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組（2.89%±0.08），并且細(xì)胞被阻滯在G2期，G0/G1期出現(xiàn)DNA亞二倍體峰。
　　結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用shRNA干擾技術(shù)，可以有效的干擾肝癌SMMC-7721細(xì)胞YAPmRNA表達(dá)并能降低YAP的生成，抑制SMMC-77