膀胱癌的分子細胞遺傳學研究.pdf

1、【目的】膀胱移行細胞癌是中國主要惡性腫瘤之一,其發(fā)生發(fā)展與癌基因的過度表達和/或抑癌基因的失活有關.分子生物學研究已取得一系列較重要的進展,然而至今還沒有找到特異的分子改變.腫瘤組織的不易培養(yǎng)使得從細胞遺傳學角度分析染色體改變較為困難.該研究應用比較基因組雜交和多色熒光原位雜交技術從整個基因組水平考察26例膀胱移行細胞癌組織標本和膀胱癌細胞系BIU87的染色體改變,繼而進一步分析染色體改變具體區(qū)域,鑒定該病非隨機性的染色體DNA擴增和缺

2、失,為闡明膀胱癌發(fā)生發(fā)展的分子基礎提供資料,為膀胱癌的預防、診斷以及治療提供有益的線索.【方法】用缺口平移法或DOP-PCR法,以生物素-16-dUTP標記腫瘤DNA,以地高辛-11-dUTP標記作為對照的胎盤DNA,將腫瘤及對照DNA探針混合,與Cot-1 DNA一起沉淀;全染色體涂染探針用PCR法,以生物素-16-dUTP、地高辛-11-dUTP分別分批標記.制備雜交液變性后與中期染色體在37℃雜交48~72小時.雜交完畢,標記生物

3、素的DNA探針用抗生物素蛋白-異硫氰酸熒光素(avidin-FITC)、羊抗生物素蛋白抗體(BAA)和第二層抗生物素蛋白-FITC檢測;標記地高辛的DNA探針用鼠源抗地高辛抗體(anti-Dig)、兔抗鼠抗體-羅丹明(TRITC)和羊抗兔抗體-TRITC檢測.用連在熒光顯微鏡上的冷電荷藕合設備相機獲取三種熒光的灰圖,灰圖經(jīng)Metamorph 圖像系統(tǒng)處理分別被賦予藍、綠、紅三色.用CGH analyzer軟件確定每條染色體的中軸,再計算

4、中軸上FITC和TRITC兩種熒光的強度并計算兩者的比值.比值低于0.8有DNA拷貝數(shù)降低,大于1.2有DNA拷貝數(shù)增加.M-FISH根據(jù)Metamorph圖像系統(tǒng)獲得的圖像直接分析染色體數(shù)目和結構的異常.【結果】26例膀胱移行細胞癌均有DNA拷貝數(shù)的變化.拷貝數(shù)增加的頻率高于拷貝數(shù)減少的頻率,平均每個患者有7.3處發(fā)生擴增和4.3處缺失.DNA拷貝數(shù)增加多發(fā)生于染色體19q(12/26)、1p(11/26)、20q(10/26)、5p

5、(9/26)、17q(9/26)、3p(8/26)、16q(8/26)、21q(8/26)、3q(7/26)、8q(7/26)、9q(7/26)、11q(7/26);3p、5p、3q和17q在一些病例中可見DNA的高度擴增.DNA拷貝數(shù)減少多發(fā)生于9q (10/26)、9p (9/26)、17p(6/26)、18q(6/26)和19p(6/26),DNA拷貝數(shù)減少發(fā)生的位點和頻率均低于既往的報導.M-FISH分析膀胱癌細胞系BIU87,