重組人p53腺病毒對胃癌細胞生長及化療敏感性的實驗研究.pdf

1、目前rAd-p53的臨床應用主要集中在頭頸部腫瘤、肺癌、乳腺癌等，涉及到胃癌的治療研究很少。順鉑、紫杉醇是臨床胃癌化療方案中常用藥物，藥物的耐藥性是限制其臨床應用的一個主要原因。本研究的目的是研究重組人p53腺病毒感染不同p53狀態(tài)胃癌細胞，觀察外源p53基因在胃癌細胞內的表達，對腫瘤細胞周期阻滯與凋亡的影響，以及對胃癌細胞化療敏感性的作用和機制。為開辟新的胃癌治療途徑，更好的使用rAd-p53治療胃癌，提高胃癌的臨床療效尤其是rAd-

2、p53與化療藥物的科學聯(lián)合應用提供可靠的實驗基礎。 材料與方法： 1.細胞選用三種攜帶不同p53狀態(tài)人胃癌細胞系BGC-823：即含野生型p53基因的細胞(略寫為W)、含突變型p53基因的細胞(略寫為M).含空載質粒即p53基因缺失的細胞(略寫為neo)。 2.實驗藥物選用 rAd-p53 (recombinant adenovirus-p53 rAd-p53)、順鉑(cis-dismine dichoropla

3、tinum，DDP)，紫杉醇(paclitaxel，TAX)。 3.MTI比色法測定不同濃度的單藥及聯(lián)合用藥作用細胞的生長抑制率，并繪制生長曲線。 4.流式細胞儀檢測細胞的周期分布和凋亡率。 5.免疫細胞化學與Western blotting法檢測感染rAd-p53細胞中p53蛋白表達。 6.統(tǒng)計學處理：采用SPSS10.0統(tǒng)計軟件，統(tǒng)計學數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(x±s)表示，計量資料滿足正態(tài)性，方差齊時多組

4、均數(shù)間比較行單因素方差分析(one-way ANOVA)，均數(shù)間的兩兩比較采用LSD方法；每組處理前后的比較用配對t檢驗；P≤0.05具顯著性。 結果： 1.免疫細胞化學法檢測顯示：5×10<'7>VP/ml rAd-p53感染三種胃癌細胞48h后，p53蛋白陽性表達于瘤細胞的細胞核內。neo對照組細胞未見p53表達，而W和M對照組細胞則呈弱陽性表達。tAd-p53作用W細胞48h后，實驗組p53的蛋白表達的陽性率(50

5、.20±4.84)％顯著高于對照組(14.15±3.44)％(P<0.001)；rAd-p53作用M細胞48h后，實驗組p53的蛋白表達的陽性率(63.74±4.21)％顯著高于對照組(30.80±5.32)％(P<0.001)；rAd-p53作用neo細胞前未見p53表達，rAd-p53作用neo細胞48h后，實驗組p53的蛋白表達的陽性率(48.87±5.88)％。 2.Western Blotting結果顯示：5×10<'

6、7>VP/ml rAd-p53感染三種胃癌細胞48h后在53KD位置上均有一條清晰的雜交帶，對照組neo細胞在同一位置無雜交帶，而對照組wW胞和M細胞則在53KD處有很淺的一條雜交帶。 3.不同濃度的rAd-p53、DDP、TAX單藥作用48h后，三種胃癌細胞生長均受到不同程度的抑制，所有實驗組與對照組間及不同濃度實驗組之間OD值比較(P<0.01)。結果顯示，三種藥物均可有效抑制三種胃癌細胞BGC-823的生長。其抑制效應呈劑

7、量依賴性。rAd-p53對BGC-823細胞的生長抑制與細胞內在的p53狀態(tài)無關。DDP、TAX同濃度組作用三種不同p53狀態(tài)的BGC-823細胞比較，作用于W細胞的生長抑制率高于M與neo細胞(P<0.01)，M與neo細胞比較P>0.05。M與neo較W細胞IC<,50>(median inhibitingconcentration,半數(shù)抑制濃度)值增高。 4.不同濃度的rAd-p53、DDP、TAX聯(lián)合用藥作用于三種胃癌細

8、胞，所有實驗組與對照組間及各實驗組之間OD值比較(P<0.01)。rAd-p53+DDP與rAd-p53+TAX對M細胞的生長抑制率高于W與neo細胞(P<0.01)，W與neo細胞比較P>0.05。實驗結果表明，rAd-p53與DDP、TAX聯(lián)合用藥，均可有效抑制三種胃癌細胞的生長,呈劑量依賴性。rAd-p53感染三種胃癌細胞48h后聯(lián)合DDP、Tax用藥較DDP、TAX單藥對細胞生長抑制率增高(P<0.01)，DDP、TAX的IC<

9、,50>值下降。 5.根據(jù)MTT結果繪制rAd-p53與DDP、TAX單用和聯(lián)合對三種胃癌細胞BGC-823的生長曲線：不同濃度的rAd-p53與DDP、TAX單用和聯(lián)合作用三種不同p53狀態(tài)的胃癌細胞24、48、72h的體外生長抑制曲線表明對胃癌細胞的抑制作用均呈時間依賴性和劑量依賴性效應。 6.流式細胞儀檢測rAd-p53與DDP、TAX單用和聯(lián)合應用對三種胃癌細胞BGC-823細胞周期變化與凋亡效應： 6.

10、1 對于W細胞，與空白對照組比：單純rAd-p53作用出現(xiàn)G<,2>/M期明顯阻滯，凋亡率為9.33％±1.27％；單純加DDP出現(xiàn)以G<,1>期為主的阻滯，凋亡率為30.8％±1.53％；單純加TAX出現(xiàn)G<,2>/M期明顯阻滯，凋亡率為33.5％±2.05％；rAd-p53+DDP發(fā)生G<,2>/M期阻滯，凋亡率為47.7％±1.66％；rAd-p53+TAX發(fā)生更明顯G<,2>/M期阻滯，凋亡率為52.8％±2.35％；以凋亡作為

11、化療增效效應，rAd-p53+DDP的增效比為1.55，rAd-p53+TAX的增效比為1.58。 6.2.對于M細胞，單純rAd-p53作用出現(xiàn)G<,2>/M期明顯阻滯，凋亡率為11.76％±2.33％；單純加DDP出現(xiàn)以G<,1>期為主的阻滯，凋亡率為24.7％±2.42％；單純加TAX出現(xiàn)G<,2>/M期明顯阻滯，凋亡率為29.89％±1.9％；rAd-p53+DDP發(fā)生G<,2>/M期阻滯，凋亡率為51.88％+2.03％；rA

12、d-p53+TAX發(fā)生更明顯G<,2>/M期阻滯，凋亡率為60.2％±2.33％；以凋亡作為化療增效效應，rAd-p53+DDP的增效比為2.1，rAd-p53+TAX的增效比為2.01。 6.3.對于neo細胞，單純rAd-p53作用出現(xiàn)G<,2>/M期明顯阻滯，凋亡率為10.97％±1.5％；單純加DDP出現(xiàn)以G<,1>期為主的阻滯，凋亡率為23.2％±1.58％；單純加TAX出現(xiàn)G<,2>/M期明顯阻滯，凋亡率為26.8％

13、±1.47％；rAd-p53+DDP發(fā)生G<,2>/M期阻滯，凋亡率為44.3％±2.26％；rAd-p53+TAX發(fā)生更明顯G<,2>/M期阻滯，凋亡率為50.53％±2.28‰以凋亡作為化療增效效應，rAd-p53+DDP的增效比為1.91，rAd-p53+TAX的增效比為1.89。 7.rAd-p53單藥感染三種細胞24、48h分別進行caspase-3蛋白表達定量分析，以公式熒光指數(shù)(FI)表示蛋白的相對含量。FI>1.

14、0為陽性表達，F(xiàn)I≤1.0為陰性表達。結果顯示：對照組W、M細胞呈弱陽性表達，neo細胞呈陰性表達。rAd-p53感染三種細胞24、48hcaspase-3蛋白表達有時間依賴性。三細胞實驗組與對照組及實驗組之間比較P<0.01。同時間組caspase-3蛋白表達比較P>0.05。 結論： 1.rAd-p53可抑制三種不同p53狀態(tài)胃癌細胞的生長及誘導細胞凋亡，該作用不受內源性p53狀態(tài)的影響。rAd-p53對細胞的生長抑

15、制作用呈劑量時間依賴性效應，并使細胞周期阻滯于G<,2>/M期。 2.rAd-p53感染三種胃癌細胞48h后實驗組三細胞均有p53蛋白強陽性表達，而對照組W、M細胞有弱陽性表達，neo細胞p53蛋白表達陰性；rAd-p53可上調凋亡相關蛋白caspase-3的表達。 3.rAd-p53聯(lián)合TAX、DDP可抑制三種胃癌細胞的生長，抑制作用較單藥時增加。聯(lián)合作用時化療藥物IC50值較單藥下降，誘導細胞凋亡率增高，細胞的周期分