血管內皮細胞TLR4介導漢灘病毒引起IRF3和NF-ΚB的核移位研究.pdf

1、漢灘病毒(Hantaan virus，HTNV)為布尼亞病毒科(family Bunyaviridae)漢坦病毒屬（Hantavirus，HV）的一種單股分節(jié)段的負鏈RNA病毒。HTNV雖以嚙齒類動物為儲存宿主，卻不引起宿主發(fā)病，然而在人類可引起兩類急性傳染?。耗I綜合征出血熱(hemorrhagic fever with renal syndrome,HFRS)和漢坦病毒肺綜合征(hantavirus pulmonary syndrom

2、e,HPS)。全世界每年大約有15萬HFRS和HPS患者，其中HFRS病例的90％以上發(fā)生在亞洲。我國是世界上HFRS疫情最嚴重的國家，HTNV是引起我國重癥HFRS的主要病原體，因此，HTNV/HFRS嚴重危害人民的健康。
　　自1978年首次從宿主動物中成功分離HV以來，國內外學者對HV及其相關疾病的病原學、流行病學、發(fā)病機制、診斷及防治等方面進行了大量的研究并取得了一系列的成果，但其發(fā)病的分子機制尚未完全明了，也沒有特異有效

3、的治療措施，安全有效的疫苗尚待進一步開發(fā)。因此，探討HV感染致病的分子機理，尋找有效的抗病毒治療藥物及研制新型HV疫苗，一直是相關領域研究的熱點。
　　目前普遍的觀點認為，HV相關疾病是由免疫介導的病理反應所致。固有免疫（innate immunity）作為機體抗感染免疫的第一道防線，在漢坦病毒感染及發(fā)病機制中可能起重要作用，然而HV誘導固有免疫的分子機制尚不清楚。HV主要通過感染血管內皮細胞從而引起機體的免疫病理反應。TLR4是

4、血管內皮細胞表面的一種重要的膜分子，參與內皮細胞抗感染的固有免疫反應。LPS是TLR4的主要配體，但是近年來發(fā)現(xiàn)TLR4在抗病毒免疫中也發(fā)揮了重要作用，HTNV可能通過與TLR4的相互作用誘發(fā)機體的固有免疫反應。前期我們研究發(fā)現(xiàn)，HTNV76-118株感染人臍靜脈內皮細胞系EVC304后可誘導TLR4的表達升高，進一步采用RNAi技術，構建了EVC304TLR4-細胞系，以此為基礎發(fā)現(xiàn)TLR4介導HTNV感染EVC304細胞所導致的IF

5、N-β，IL-6和TNF-α的表達升高，TLR4信號轉導途徑中TRIF的表達在HTNV感染前后變化明顯，而MyD88的表達變化不明顯。本研究以上述為基礎，通過間接免疫熒光實驗觀察TLR4下游轉錄因子IRF-3和NF-κB的細胞核移位以及它與HTNV感染的時程關系，同時以RT-PCR和間接免疫熒光方法觀察HTNV感染EVC304細胞后，TLR4是否介導細胞間粘附分子-1（ICAM-1）的表達變化，闡明TLR4信號轉導通路在HTNV感染EV

6、C304細胞中的作用，為HFRS的發(fā)病機理研究和藥物研制提供新資料。
　　本課題研究內容和結果如下：
　　1.HTNV的培養(yǎng)及其對EVC304細胞的感染
　　培養(yǎng)Vero細胞，然后用本室所保存的HTNV76-118株感染Vero細胞，通過Vero細胞的傳代進一步擴增HTNV，7-10天后反復凍融Vero細胞并分離上清。然后培養(yǎng)EVC304TLR4+細胞和EVC304TLR4-細胞，用制備的HTNV上清分別感染，發(fā)現(xiàn)HT

7、NV可以有效地感染這兩種細胞。
　　2.EVC304TLR4-細胞中的TLR4表達檢測
　　分別培養(yǎng)EVC304TLR4+細胞和EVC304TLR4-細胞，各取1×106個細胞提取總RNA，用半定量RT-PCR來檢測兩種細胞中TLR4的表達情況。結果表明在EVC304TLR4-細胞中TLR4表達水平很低（即在該細胞中TLR4能被有效抑制），提示EVC304TLR4-細胞可以在本實驗中用于研究TLR4的基因功能。
　　3

8、.轉錄因子IRF-3和NF-kB的細胞核移位及其與HTNV感染的時程關系
　　HTNV分別感染EVC304TLR4+細胞和EVC304TLR4-細胞，以LPS刺激作為陽性對照組，以未進行任何刺激組作為陰性對照組。觀察在感染后0.5h、1h、3h、6h、12h后轉錄因子IRF-3和NF-kB的細胞核移位情況。結果發(fā)現(xiàn)在所有組中刺激0.5h后IRF-3和NF-kB都沒有發(fā)生細胞核移位，在感染EVC304TLR4+細胞1h、3h、6h后

9、IRF-3和NF-kB發(fā)生了細胞核移位，其中以感染6h的細胞核移位最為明顯，而在12h時沒有觀察到細胞核移位現(xiàn)象。在HTNV感染EVC304TLR4-各組中各個時段均未發(fā)現(xiàn)細胞核移位現(xiàn)象。
　　4.粘附分子ICAM-1在HTNV感染前后的表達
　　HTNV分別感染EVC304TLR4+細胞和EVC304TLR4-細胞6h后，用RT-PCR和間接免疫熒光技術分別檢測粘附分子ICAM-1的表達變化，結果顯示HTNV感染EVC30

10、4前后以及TLR4基因沉默前后ICAM-1變化不明顯，且陽性對照組變化亦不明顯。
　　結論：HTNV①感染EVC304細胞后TLR4可能介導轉錄因子IRF-3和NF-kB的細胞核移位，且在一定時間內（1-6h），核移位隨感染時間延長而增加。HTNV②感染EVC304細胞前后，ICAM-1變化不明顯，且與TLR4沉默與否無明顯關系。本實驗初步闡明了在HTNV感染EVC304細胞中TLR4所引起的固有免疫信號通路活化的分子機制，為HF