組織切片技術(shù)

1、組織切片技術(shù)組織切片技術(shù)姓名：許莎班級(jí)：生技121學(xué)號(hào)：12772018組織切片技術(shù)是研究生物組織或細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)的重要技術(shù)，對(duì)于促進(jìn)細(xì)胞生物學(xué)和遺傳學(xué)等研究的發(fā)展起著重要作用。最早的制片技術(shù)是徒手切片技術(shù)，以后發(fā)展了利用石蠟進(jìn)行包埋和切片的制片技術(shù)，即石蠟切片技術(shù)，該技術(shù)由于成本低，操作簡(jiǎn)單，目前仍在應(yīng)用，該技術(shù)被越來(lái)越多的研究工作者應(yīng)用于發(fā)育學(xué)、植物細(xì)胞學(xué)、胚胎學(xué)、解剖學(xué)等研究領(lǐng)域。1組織切片技術(shù)原理組織切片技術(shù)原理1.1原理原理組

2、織切片技術(shù)是研究組織形態(tài)學(xué)最常用的一項(xiàng)基本技術(shù)，在制作胚胎或組織切片時(shí)，由于細(xì)胞或組織是柔軟的或局部的軟硬不均，這樣制作厚薄均勻的切片很困難。為了能清晰地觀察到組織結(jié)構(gòu)及細(xì)胞形態(tài)，必須先經(jīng)過(guò)一系列步驟將組織內(nèi)滲入某些支持物質(zhì)，使組織變硬然后利用切片機(jī)將組織切成薄片。根據(jù)所用支持劑的種類不同，主要分為石蠟切片、冰凍切片、振動(dòng)切片、火棉膠切片、塑料切片、碳蠟切片等。1.2分類分類1.2.1石蠟切片該技術(shù)是最重要、最常用的組織切片技術(shù)之一，起

3、始于18世紀(jì)。此法是用石蠟作為包埋劑，將材料經(jīng)過(guò)固定、脫水、透明后包埋在石蠟中，然后連同石蠟用切片機(jī)一同進(jìn)行切片。石蠟切片的主要優(yōu)點(diǎn)是不僅可以把材料制成薄的切片，而且還能制成連續(xù)切片，這是其他制片技術(shù)難以做到的。它的缺點(diǎn)是操作步驟比較復(fù)雜，而且材料在脫水、透明過(guò)程中會(huì)收縮、變硬、變脆，以致不易切片[1]。1.2.2冰凍切片冰凍切片是利用干冰或液氮等速凍劑使組織迅速冷凍硬化，將組織在冷凍狀態(tài)下直接用切片機(jī)切片的一項(xiàng)技術(shù)。它實(shí)際上是以水為包

4、埋劑，將組織進(jìn)行冰凍至堅(jiān)硬后切片的。由于此法不需要經(jīng)過(guò)各級(jí)乙醇的脫水、二甲苯的透明和浸蠟等步驟，因而較適合子脂肪、神經(jīng)組織和一些組織化學(xué)的制片，并作為快速切片的方法應(yīng)用在臨床診斷冰凍切片是酶組織化學(xué)和免疫組織化學(xué)染色中最常用的一種切片方法。此種切片的優(yōu)點(diǎn)是能較好的保存組織的RNA穩(wěn)定性、較完好地保存細(xì)胞膜表面和細(xì)胞內(nèi)多種酶活性以及抗原的免疫活性，缺點(diǎn)是需要較高的設(shè)備要求切片較厚，導(dǎo)致組織結(jié)構(gòu)顯示欠佳通常不能進(jìn)行連續(xù)切片。其主要操作技術(shù)和

5、方法與石蠟切片過(guò)程和類似。1.2.3振動(dòng)切片是用振動(dòng)切片機(jī)把新鮮的組織切成厚20100pm的切片。此類切片的優(yōu)缺點(diǎn)類似于冰凍切片。通常在切片后進(jìn)行免疫染色然后再進(jìn)行電鏡切片以此來(lái)彌補(bǔ)結(jié)構(gòu)顯示不清的不足。振動(dòng)切片機(jī)主要用于新鮮或經(jīng)過(guò)固定的動(dòng)、植物標(biāo)本的制片，切片時(shí)組織標(biāo)本不需冰凍或包埋。因此.樣品片既避免了冰晶破壞，又能保持其活性和細(xì)胞良好形態(tài)為免疫細(xì)胞化學(xué)研究以及脊髓和腦薄片的神經(jīng)生物學(xué)研究提供了良好條件。振動(dòng)式切片機(jī)可以對(duì)不同的材料進(jìn)

6、行切片，在應(yīng)用范圍上補(bǔ)充了使用傳統(tǒng)切片機(jī)的不足，是當(dāng)代電鏡、解剖、組胚、生理、醫(yī)院化工等實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)最理想的快速制樣切片儀器。1.2.4火棉膠切片黑紙上。切片操作時(shí)應(yīng)注意隨時(shí)關(guān)好停刀軋，不能對(duì)著蠟帶講話以免吹散蠟帶切片完畢，將刀取下擦凈。涂上潤(rùn)滑油，放人盒內(nèi)保存。9.粘片、展片：通過(guò)粘貼劑把合格蠟帶貼在載玻片上，在貼的同時(shí)，借助水的張力使蠟帶完全伸展、平貼在載玻片上，粘片和展片是在載玻片上同時(shí)完成的步驟。常用的粘貼劑有蛋白粘貼劑和明膠甘油粘

7、貼劑兩種10.脫蠟、透明：在染色之前，需要用脫蠟劑溶去組織和細(xì)胞的石蠟，進(jìn)一步清洗脫掉的石蠟，使細(xì)胞、組織透明清晰，用于脫蠟和透明的試劑是二甲苯。11.染色：為了使植物組織和細(xì)胞各部分顯像清楚，必須進(jìn)行染色。運(yùn)用不同的染色方法和選用不同的染色劑，使組織或細(xì)胞某一部分染上顏色，另一部分不染上顏色成為背景或?qū)⒉煌糠秩境刹煌念伾?，可使組織細(xì)胞在光學(xué)顯微鏡中顯像清晰，便于觀察。12封片：切片染色后用膠類物質(zhì)將其封固，以利于長(zhǎng)期保存。2切片技

8、術(shù)的應(yīng)用切片技術(shù)的應(yīng)用2.1石蠟切片技術(shù)的應(yīng)用石蠟切片技術(shù)的應(yīng)用石蠟切片雖然是經(jīng)典的方法但隨著新的儀器和研究技術(shù)的不斷問(wèn)世，出現(xiàn)了與其他新的技術(shù)方法相結(jié)合，從而開(kāi)辟了許多新領(lǐng)域[2]，增加了許多新的研究、觀察內(nèi)容，使組織學(xué)的觀察研究從簡(jiǎn)單的形態(tài)結(jié)構(gòu)深入到各種成分的定性觀察，定量計(jì)測(cè)，使細(xì)胞組織的形態(tài)、功能及代謝三結(jié)合，從而達(dá)到定性可靠、定位準(zhǔn)確及定量可測(cè)，最終闡述了生命活動(dòng)的最基本規(guī)律。2.1.1三維重建重建技術(shù)在闡明生物體組織結(jié)構(gòu)與生

9、理功能之間的關(guān)系以及在形態(tài)學(xué)、比較解剖學(xué)、細(xì)胞化學(xué)定位等領(lǐng)域的研究中有著重要的意義。早在1958年，Sjostr就論證了這種方法的可行性和可靠性[3]，是最早報(bào)道利用組織切片進(jìn)行骨二維重建的學(xué)者，隨后LUCZ也用同樣的方法進(jìn)行了嘗試，但是，由于當(dāng)時(shí)的切片技術(shù)和計(jì)算機(jī)技術(shù)都較落后，故效果不如人意。直到2000年Mason[4]再次用同樣的方法進(jìn)行了三維重建。隨著計(jì)算機(jī)技術(shù)的不斷發(fā)展，這項(xiàng)技術(shù)在國(guó)際上正在繼續(xù)進(jìn)行廣泛深入的研究，在國(guó)內(nèi)也引起

10、了廣泛的研究興趣，例如對(duì)血管大鼠松質(zhì)骨、中國(guó)虛擬人[5]行切片后三維重建，同時(shí)也對(duì)方法進(jìn)行了很多研究。特別是目前正在研究的“中國(guó)虛擬人1號(hào)”，表明我國(guó)是繼美、韓之后世界上第三個(gè)用人體切片合成虛擬人的國(guó)家。2.1.2免疫組化組織制片技術(shù)與免疫學(xué)技術(shù)結(jié)合構(gòu)成免疫組織化學(xué)技術(shù)，利用抗原與抗體的特異性結(jié)合原理，檢測(cè)組織切片中細(xì)胞組織的多肽及蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)的定性和定位觀察研究。冰凍切片手續(xù)簡(jiǎn)便，制片過(guò)程中抗原活性丟失少，但組織細(xì)胞形態(tài)較差石蠟

11、切片步驟繁多。一般石蠟包埋的組織切片用于檢測(cè)胞漿或核內(nèi)的抗原，不宜做表面抗原染色，乙醇、丙酮等固定劑對(duì)抗原破壞較輕，但結(jié)構(gòu)保存較差。2.1.3原位雜交隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，在SouthernblotNthernblot等分子雜交技術(shù)基礎(chǔ)上建立了原位雜交技術(shù)。原位雜交技術(shù)具有高度的準(zhǔn)確性和敏感性，它能在細(xì)胞甚至亞細(xì)胞的水平上定位特異性核酸分子序列。因而，這一技術(shù)是目前研究分子細(xì)胞生物學(xué)、發(fā)育學(xué)等方面的重要手段[6]。例如，在心肌石蠟切片中